땅콩 잎에서 게놈 DNA의 분리 :단계별 가이드
이 프로토콜은 간단하고 비용 효율적인 접근법을 사용하여 땅콩 잎에서 게놈 DNA를 추출하는 기본 방법을 설명합니다.
재료 :
* 그라운드 잎 (신선 또는 냉동)
* 액체 질소
* 박격포와 유봉
* 1.5 ml 미세 원심 분리 튜브
* 100 mm Tris-HCL (pH 8.0)
* 25 mm EDTA (pH 8.0)
* 1.4 M NaCl
* 10% SDS (나트륨 도데 실 설페이트)
* 클로로포름 :이소 아밀 알코올 (24 :1)
* 이소프로판올
* 70% 에탄올
* RNase A 용액 (10 mg/ml)
* 분광 광도계
절차 :
1. 샘플 준비 :
* 신선하거나 얼어 붙은 땅콩 잎을 모으십시오. 냉동 잎을 사용하는 경우 실온에서 해동하십시오.
* 약 0.1-0.2g의 잎 조직의 무게.
* 잎을 미리 냉각 모르타르에 넣고 액체 질소를 사용하여 미세 분말로 갈아냅니다.
2. 용해 :
* 분말 잎을 1.5 ml 미세 원심 분리 튜브로 옮깁니다.
* 500 ㎕의 용해 완충액 (100 mM Tris-HCL, pH 8.0, 25 mM EDTA, pH 8.0, 1.4 M NACL 및 10% SDS)을 첨가하십시오.
* 가끔 부드러운 흔들림으로 튜브를 65 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오. 이 단계는 세포벽과 막을 분해하여 DNA를 방출합니다.
3. 단백질 제거 :
* 튜브에 200 ㎕의 클로로포름 :이소 아밀 알코올 (24 :1)을 첨가하십시오.
* 튜브를 10 분 동안 격렬하게 흔들어줍니다.
* 실온에서 10 분 동안 10,000 x g에서 튜브를 원심 분리하십시오. 이 단계는 용액을 3 개의 층으로 분리합니다 :수성 층 (상단), 인터상 (중간) 및 유기 층 (하단). DNA는 수성 층에있다.
4. DNA 강수량 :
* 수성 층을 새로운 1.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.
* 튜브에 0.5 부피의 이소프로판올을 첨가하고 부드럽게 섞는다. 이것은 용액에서 DNA를 침전시킬 것이다.
* 튜브를 -20 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오.
* 4 ° C에서 10 분 동안 10,000 x g에서 튜브를 원심 분리하십시오. DNA 펠렛은 튜브 바닥에 형성됩니다.
5. 세척 및 건조 :
* 상청액을 제거하고 500 ㎕의 70% 에탄올로 DNA 펠렛을 세척하십시오.
* 4 ° C에서 5 분 동안 10,000 x g에서 튜브를 원심 분리하십시오.
* 에탄올을 제거하고 5-10 분 동안 펠렛을 공기로 공기로 공기로 건조시킵니다.
6. 재현 탁 및 RNase 처리 :
* DNA 펠렛을 50 ㎕의 TE 완충제 (10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 재현 탁시킨다.
* 튜브에 1 ㎕의 RNase A 용액 (10 mg/ml)을 첨가하십시오.
* 남은 RNA를 제거하기 위해 튜브를 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션한다.
7. DNA 정량화 및 품질 점검 :
* 260 nm 및 280 nm 파장에서 분광 광도계를 사용하여 추출 된 DNA를 정량화합니다. 260 nm/280 nm의 흡광도의 비율은 1.8에서 2.0 사이 여야하며, 이는 순수한 DNA를 나타냅니다.
참고 :
*이 프로토콜은 기본 지침이며 특정 잎 재료와 DNA의 원하는 품질에 따라 적응해야 할 수도 있습니다.
* 생물학적 샘플을 처리 할 때 항상 장갑과 실험실 코트를 착용하십시오.
* 오염을 피하기 위해 모든 시약과 장비가 멸균되는지 확인하십시오.
*보다 간소화되고 효율적인 프로세스를 위해 상용 DNA 추출 키트를 사용할 수도 있습니다.
추가 응용 프로그램 :
* 분리 된 게놈 DNA는 다음을 포함한 다양한 분자 생물학 응용에 사용될 수 있습니다.
* PCR (중합 효소 연쇄 반응)
* DNA 시퀀싱
* 유전자 분석
* 복제
이 프로토콜은 게놈 DNA를 땅콩 잎에서 분리하여 다양한 연구 및 응용 분야의 길을 열어주는 간단하고 비용 효율적인 방법을 제공합니다.
