1. 표적 단백질에 대한 mRNA를 분리하십시오 :
* RNA 추출 : 과학자는 개구리에서 간 조직을 얻고 총 RNA를 추출해야합니다. 여기에는 세포를 방해하고 특수 시약을 사용하여 다른 세포 성분과 RNA를 분리하는 것이 포함됩니다.
2. cDNA 라이브러리 만들기 :
* 역전사 : 분리 된 mRNA를 사용하여 과학자는 역전사를 수행합니다. 이것은 역전사 효소라고하는 효소가 mRNA를 상보적인 DNA (cDNA)로 전환시키는 과정이다. 이 cDNA는 클로닝을위한 템플릿으로 작용할 것입니다.
* cDNA 라이브러리 구성 : 이어서, cDNA를 박테리아 내에서 복제 할 수있는 벡터 (보통 플라스미드)에 삽입된다. 다른 cDNA 단편을 함유하는 벡터 컬렉션을 cDNA 라이브러리라고합니다.
3. 대상 cDNA의 라이브러리를 스크리닝하십시오 :
* 프로브 설계 : 과학자는 원하는 개구리 단백질을 코딩하는 cDNA를 식별하기 위해 프로브가 필요합니다. 이 프로브는 다음과 같습니다.
* 올리고 뉴클레오티드 프로브 : 표적 단백질의 알려진 서열 (가능한 경우)에 기초하여 설계된 짧고 합성 DNA 서열.
* 항체 프로브 : 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 라이브러리에서 상응하는 cDNA를 검출 할 수있다.
* 스크리닝 : cDNA 라이브러리는 프로브로 스크리닝됩니다. 이것은 다음과 같은 기술을 사용하여 수행 할 수 있습니다.
* 식민지 혼성화 : cDNA 라이브러리를 함유하는 박테리아는 한천에 도금된다. 프로브에 라벨이 붙어 식민지에 결합 할 수 있습니다. 표적 cDNA를 함유하는 콜로니는 프로브로 혼성화되어 식별 될 수있다.
* PCR 스크리닝 : PCR (중합 효소 연쇄 반응)을 사용하여 알려진 서열로부터 설계된 프라이머를 사용하여 표적 cDNA를 증폭시킬 수있다.
4. 시퀀스 및 대상 cDNA를 확인하십시오 :
* Sanger 시퀀싱 : 일단 표적 cDNA가 분리되면, 동일성을 확인하고 IT가 올바른 단백질을 코딩하는지 확인하기 위해 서열화되어야한다.
* 생물 정보학 분석 : cDNA 서열은 데이터베이스와 비교하여 상 동성 서열을 찾고 그 동일성을 확인할 수 있습니다.
5. 표현식 벡터를 설계하고 구성합니다.
* 발현 벡터 : 과학자는 적합한 숙주 유기체 (예 :박테리아, 효모 또는 포유 동물 세포)에서 표적 단백질을 발현하는 데 사용될 수있는 벡터가 필요합니다. 이 표현식 벡터는 다음을 포함합니다.
* 프로모터 : 표적 유전자의 발현을 유도하는 DNA 서열.
* 표적 유전자 (cDNA) : 개구리 단백질을 암호화하는 단리 된 cDNA.
* 리보솜 결합 부위 (RBS) : 리보솜이 단백질 합성을 시작하는 데 도움이되는 서열.
* 선택 마커 : 발현 벡터를 취한 세포의 선택을 허용하는 유전자.
6. 발현 벡터를 숙주 유기체로 변환하십시오 :
* 변형 : 표적 cDNA를 함유하는 발현 벡터는 숙주 유기체 (예를 들어, 박테리아 세포)에 도입된다.
* 선택 : 형질 전환 된 셀은 발현 벡터에서 선택 마커를 사용하여 선택된다.
7. 표적 단백질을 표현하고 정제합니다 :
* 단백질 발현 : 숙주 세포는 표적 단백질의 발현을 촉진하는 조건 하에서 성장한다.
* 단백질 정제 : 단백질은 세포로부터 추출되고 크로마토 그래피와 같은 기술을 사용하여 다른 세포 성분과 분리된다.
8. 특성화 및 분석 :
* 검증 : 정제 된 단백질을 분석하여 동일성, 폴딩 및 활동을 확인합니다.
* 기능 연구 : 단백질은 기능을 조사, 다른 분자와의 상호 작용 또는 잠재적 치료 용도와 같은 추가 연구에 사용될 수 있습니다.
중요한 고려 사항 :
* 단백질 폴딩 : 숙주 유기체에서 단백질을 올바르게 접는 것이 중요합니다.
* 번역 후 수정 : 일부 단백질은 번역 후 변형 (예를 들어, 글리코 실화)이 필요하다. 숙주 유기체는 이러한 변형을 수행하지 못할 수 있으며, 이는 단백질의 기능에 영향을 줄 수 있습니다.
* 윤리 및 안전 : 개구리 조직 및 유전자 변형 유기체로 작업 할 때 적절한 윤리적 고려 사항과 안전 프로토콜을 따라야합니다.
특정 단계에 대해 자세한 내용을 원하시면 알려주세요!
