1. 박테리아 DNA의 분리
* 1 단계 :세포 용해 : 박테리아 세포는 DNA를 포함하여 내용물을 방출하기 위해 열린 상태로 파손된다. 이것은 다음과 같이 달성 할 수 있습니다.
* 기계적 방법 :
* 프랑스 언론 : 이 장치는 좁은 개구부를 통해 세포를 강요하여 고압을 만들고 파열시킵니다.
* 초음파 처리 : 고주파 음파는 세포를 진동시키는 데 사용되어 분리됩니다.
* 비드 밀링 : 세포는 작은 구슬로 고속 교반을받으며, 이는 세포벽을 물리적으로 방해합니다.
* 화학적 방법 :
* 효소 : 리소자임 (그람 양성 박테리아의 경우) 또는 펩티도 글리 칸 (세포벽)을 분해하는 효소는 세포벽을 소화하는 데 사용됩니다.
* 세제 : 이들 제제는 세포막을 방해하여 세포 함량을 방출한다.
* 2 단계 :세포 잔해 제거 : 용해 후, 세포 용 해물 (세포 함량의 혼합물)을 청소해야합니다. 이것은 전형적으로 세포 잔해, 단백질 및 기타 분자로부터 DNA를 분리하기위한 원심 분리를 포함한다.
* 3 단계 :DNA 정제 : 나머지 DNA는 다양한 방법을 사용하여 추가로 정제됩니다.
* 페놀 클로로포름 추출 : 이 고전적인 기술은 페놀과 클로로포름의 혼합물을 사용하여 단백질로부터 DNA를 분리한다. DNA는 수성 단계로 유지되는 반면 단백질은 유기상으로 추출됩니다.
* 컬럼 크로마토 그래피 : 다양한 상업적으로 이용 가능한 키트는 DNA를 선택적으로 결합하는 수지가있는 컬럼을 사용하여 정제를 허용합니다.
* 강수 : DNA는 에탄올 또는 이소프로판올을 사용하여 용액으로부터 침전되어 농축 펠렛을 초래한다.
2. 박테리아 DNA의 조작
* 제한 효소 : 이들 효소는 특정 서열에서 DNA를 절단하는데 사용되어 유전자 클로닝에 적합한 단편을 생성한다.
* ligases : DNA 단편을 결합시키는 효소. 그들은 유전자를 벡터에 삽입하는 데 필수적입니다.
* 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) : 이 기술은 특정 DNA 서열의 증폭을 허용한다. 복제를위한 여러 유전자 카피를 생성하거나 더 큰 게놈으로부터 특정 DNA 단편을 분리하는 데 사용됩니다.
3. 클로닝 벡터의 준비
* 벡터 : 이들은 외래 DNA를 박테리아 세포로 운반하는 비히클로서 작용하는 DNA 분자 (종종 플라스미드 또는 박테리오파지)이다.
* 벡터 수정 :
* 제한 효소 소화 : 벡터는 제한 효소로 절단되어 외래 DNA를 삽입 할 수있는 열린 "끈적 끈적한 끝"을 생성합니다.
* 결찰 : 외래 DNA 단편은 DNA 리가 제를 사용하여 벡터로 결합 (결합)된다.
4. 형질 전환 (박테리아로의 유전자 전달)
* 유능한 세포 : 박테리아는 외래 DNA를 복용하는 것을 더 잘 받아들이도록 치료됩니다. 이것은 다양한 방법으로 수행 할 수 있습니다.
* 화학 처리 : 염화 칼슘 (CACL2) 또는 염화 마그네슘 (MGCL2)과 같은 용액을 사용하여 박테리아 세포벽을 더 투과성으로 만드는 데 사용됩니다.
* 전기 천공 : 간단한 전기 펄스는 박테리아 세포막에 일시적 구멍을 생성하여 DNA가 들어갈 수있게한다.
* 변형 : 유능한 세포는 재조합 벡터에 노출되어 벡터가 박테리아 세포로 들어갈 수있게한다.
* 선택 : 벡터는 전형적으로 항생제 내성 유전자를 운반합니다. 이를 통해 과학자들은 벡터를 성공적으로 가져간 박테리아 세포를 선택할 수 있습니다.
키 포인트
* 안전 : 멸균 기술은 오염을 방지하기 위해 DNA 준비에서 중요합니다.
* 품질 관리 : 분리 된 DNA의 품질은 성공적인 유전자 전달에 필수적입니다.
* 응용 프로그램 : 이러한 기술은 유전자 클로닝, 단백질 생산 및 유전자 변형 유기체의 생성을 포함한 다양한 유전자 공학 응용에 중요합니다.
박테리아 DNA 준비 또는 유전자 전달의 특정 측면에 대한 자세한 내용을 원하시면 알려주세요!
