폴리머 라제 연쇄 반응 또는 PCR은 DNA 가닥의 수천 마리의 카피를 생성하는 방법이다. 그것은 실험실 조건 하에서 유전자 물질의 사본을 생성하는 중합 효소 효소의 능력을 이용합니다.
DNA (Deoxyribonucleic acid)는 살아있는 유기체와 관련된 수많은 연구 연구의 토대를 형성합니다. DNA 코드에서, 우리는 질병의 유전 적 기초를 수집하고, 약물을 개발하고, 법의학 검사를 수행하고, 미생물을 식별하는 등을 훨씬 더 많이 식별 할 수 있습니다.
그러한 연구에 필요한 가장 기본적인 것은 조사중인 다량의 DNA 단편입니다. 그러나, 세포, 조직 또는 다른 생물학적 공급원으로부터 분리 된 DNA는 종종 분석에 충분하지 않다. 따라서 과학자들은 더 많은 DNA 사본을 만들어야합니다.
이것은 "중합 효소 연쇄 반응"의 중요한 역할이 그림에 나오는 곳입니다.
중합 효소 연쇄 반응은 무엇입니까?
PCR은 실험실 조건 하에서 유전자 물질의 사본을 생성하는 중합 효소 효소의 능력을 이용합니다.
PCR 전에, 특정 DNA 단편을 분리하고 살아있는 세포의 게놈에 삽입함으로써 DNA 사본을 만들었다. 살아있는 세포는 자신의 DNA를 복제하면서 삽입 된 DNA를 복제했습니다. 이 기술은 추가 연구를하기에 충분한 DNA 카피를 생성하는 힘들고 시간이 많이 걸리는 방법이었습니다.
그러나 이것은 더 이상 그렇지 않습니다. 이 발전에 대한 대부분의 크레딧은 1983 년에“폴리머 라제 연쇄 반응”(PCR)을 발명 한 Kary Mullis에게 간다. 오늘날 PCR은 소규모 실험실에서도 매우 일반적인 실험실 기술이며 정기적으로 DNA 사본을 생성하는 데 사용됩니다.
PCR은 종종 "분자 사본"으로 알려진 과정을 통해 관심있는 DNA 사본을 선택적으로 만들 수 있습니다. PCR을 사용하여 DNA의 여러 카피가 합성되면 DNA는 "증폭"됩니다.
중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 시험 관내에서 이다 DNA 폴리머 라제를 사용하여 관심있는 DNA의 여러 카피를 생성하는 기술. (사진 크레딧 :Kozhedub_nc/Shutterstock)
PCR 반응의 구성 요소는 무엇입니까?
PCR 반응의 주요 성분은 주형 DNA, 프라이머, 뉴클레오티드 및 열 안정 DNA 폴리머 라제이다. 이러한 각 구성 요소에 대해 간단히 배우겠습니다.
가장 간단한 박테리아에서 가장 복잡한 동물 및 식물로의 DNA는 PCR에 사용될 수 있습니다. 그러나 전체 DNA (주형 DNA)는 PCR을 통과하지 않습니다. 과정에서 작은 섹션 만 증폭됩니다.
DNA가 증폭되기 위해서는 프라이머 (약 20 bp)의 스트레치가 매우 중요합니다. 프라이머 세트가 전방 프라이머 및 리버스 프라이머 모두 사용됩니다. 프라이머는 DNA 가닥의 시작 및 끝에 결합하여 DNA 가닥이 증폭되어야하는 지점을 알리는 지시를한다.
.PCR 반응에 사용 된 뉴클레오티드는 DNA에서 발견되는 4 개의 질소 염기의 혼합물이다. 그들은 아데닌 (A), 티민 (T), 구아닌 (G) 및 시토신 (C)입니다.
마지막이자 가장 중요한 성분은 DNA 폴리머 라제입니다. 중합 효소 효소는 기존 가닥에 상보적인 방식으로 뉴클레오티드를 조립함으로써 새로운 DNA 분자를 만듭니다. 이런 식으로, 그것은 실제로 단일 가닥의 DNA에서 두 개의 동일한 DNA 분자를 만들 수 있습니다.
효소와 함께, DNA 폴리머 라제의 작용에 필요한 보조 인자는 반응 혼합물에 첨가되어야한다. 공동 인자는 효소 활성에 중요한 금속 화합물입니다. 마그네슘 이온은 DNA 폴리머 라제의 보조 인자입니다.
PCR에 사용 된 DNA 폴리머 라제는 고온에서 살아남을 수있는 호 열성 유기체로부터 분리 된 온도 역할성 DNA 폴리머 라제 (종종 TAQ 폴리머 라제)이다.
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PCR 반응의 성분은 템플릿 DNA, TAQ DNA 폴리머 라제, 완충제, 뉴클레오티드 염기 (DATP, DTTP, DGTP, DCTP), 상류 (순방향) 프라이머, 다운 스트림 (역) 프라이머 및 초음파수를 포함한다. (사진 크레딧 :Oscar Daniel Luna Ramos/Shutterstock)
PCR 반응의 단계는 무엇입니까?
이제 PCR에 필요한 모든 구성 요소를 알았으므로 PCR 반응과 관련된 세 단계를 확인해 봅시다. 단계는 변성, 어닐링 및 확장입니다.
중합 효소의 활성은 프라이머가 결합 할 수있는 단일 단일 가닥 DNA의 존재에 의존한다. 이것은 94-98 ° 에서 DNA 샘플을 가열하여 단순히 달성 할 수 있습니다. c.
가열은 두 DNA 가닥을 함께 고정하는 결합을 깨뜨립니다. 프로세스를 denaturation, 이라고합니다 이중 가닥 DNA 분자는 2 개의 단일 가닥 분자로 변성된다. 하나의 DNA 가닥은 템플릿 가닥이라고 불리며 그 쌍은 보완 가닥이라고합니다.
다음 단계는 프라이머가 특정 부위에서 템플릿 DNA에 결합 (어닐링)을 결합해야합니다. 전방 프라이머는 3 bp 뉴클레오티드 서열 ATG (시작 코돈)에서 주형 DNA (이중 가닥 DNA상의 1 가닥)의 시작에 결합한다. 역 프라이머는 3 BP 뉴클레오티드 서열 TAG, TAA 또는 TGA (정지 코돈)에서 상보한 DNA (이중 가닥 DNA의 두 번째 가닥) 가닥의 끝에 결합한다. 시작과 정지 코돈 사이의 DNA가 증폭됩니다.
이 단계의 성공은 프라이머 시퀀스와 어닐링을 위해 선택된 온도, 일반적으로 50-65 ° 에 따라 다릅니다. 기음.
마지막 단계와 마지막 단계는 신장 또는 종료입니다. 72 ° 에서 발생합니다. C, TAQ 폴리머 라제의 활성에 대한 최적 온도. DNA 폴리머 라제는 DNA의 프라이머-결합 영역을 인식하고 주형 DNA 가닥에 상보한 뉴클레오티드를 첨가 할 것이다. 이것은 두 번째 프라이머가 발생할 때까지 발생합니다.
성공적인 종결 반응 후, 초기 단계에서 사용 된 하나의 DNA 나선 대신 2 개의 DNA 나선이있을 것이다. 2 개의 DNA 나선 각각에서, 하나의 가닥은 DNA 샘플에서 제공하는 원래 가닥이 될 것이다. 다른 가닥은 PCR 동안 DNA 폴리머 라제에 의해 합성 된 상보 적 가닥이다.
PCR 반응의 3 단계는 변성, 어닐링 및 확장 또는 종료입니다. (사진 크레디트 :Flickr)
PCR을 사용한 DNA 증폭의 원리는 무엇입니까?
변성, 어닐링 및 중합 단계는 하나의 PCR 사이클을 포함한다. 전형적인 PCR 반응은 최적의 DNA 증폭을 위해 25-35 사이클을 필요로 할 수 있습니다.
한주기가 끝나면 단일 DNA 주형은 2 개의 DNA 분자를 형성합니다. 두 사이클이 끝날 무렵, 2 개의 DNA는 4 개의 DNA 분자를 형성하여 3 개의 사이클이 끝날 때 8 개의 DNA 분자로 증폭 될 것이다. N 사이클이 끝나면 원래 DNA 템플릿의 2n 사본이 있습니다.
각주기 후, 다음 사이클을위한 템플릿으로 작용할 수있는 DNA 분자의 수는 기하 급수적으로 증가합니다. 사이클 후 템플릿 수 사이클의 이러한 증가는 PCR에서 DNA 분자의 증폭의 기초입니다.
PCR 기술을 사용한 DNA 분자의 지수 증폭 (사진 신용 :Enzoklop/Wikimedia Commons)
PCR의 1 차 적용은 혼합 DNA 샘플로부터 선택적 DNA 분리이다. 이것은 단기간에 전염병, 유전 질환 및 여러 유형의 암을 진단하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 법의학에서 범죄자를 식별하고 부모 테스트를 위해 사용됩니다.
그것은 분자 생물학, 유전자 클로닝, 재조합 DNA 기술 및 돌연변이 유발과 관련된 대부분의 응용의 기초를 형성합니다.
결론
Kary Mullis가 규정 한 간단하고 다재다능한 PCR 기술의 실질적인 발전은 생물학적 연구를 크게 변화 시켰습니다. 우리가해야 할 일은 PCR의 모든 구성 요소를 작은 튜브에 적절한 농도로 혼합하고 PCR 기계 (Thermocycler)에로드 한 다음 몇 시간을 기다리는 것입니다. 대기 기간이 지나면 연구원들은 수백만에서 10 억 을 가질 것입니다. 관심있는 DNA 사본. 그렇게 놀랍지 않습니까?
이것이 PCR 이이 게임 변화 발견 이전에 사용 된 방법과 비교하여 DNA 카피를 생성하기위한 빠르고 신뢰할 수있는 기술이되는 이유입니다.
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