PCR이 DNA 시퀀싱 과정에서 사용되는 이유

DNA 시퀀싱은 특정 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 데 사용되는 기술입니다. Sanger 시퀀싱 및 차세대 시퀀싱은 두 가지 유형의 시퀀싱 방법입니다. 형광 마커는 서열에서 각 뉴클레오티드를 식별하는 데 사용된다. PCR은 형광 마커를 DNA 단편에 통합하는 데 사용됩니다. PCR (중합 효소 연쇄 반응)은 실험실에서 특정 DNA 단편의 수백만 장의 사본을 생산하는 데 사용되는 기술입니다. 겔에서 PCR 단편의 분석은 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열의 결정을 허용한다.

주요 영역이 적용됩니다

1. 시퀀싱이란 무엇입니까
-정의, 시퀀싱 유형-차세대 시퀀싱, Sanger 시퀀싱
2. PCR이 DNA 시퀀싱 과정에서 사용되는 이유
- PCR 동안 형광 염료 통합

주요 용어 :DDNTP, DNTP, DNA 시퀀싱, 형광 염료, 차세대 시퀀싱, PCR, Sanger 시퀀싱

시퀀싱이란 무엇입니까

시퀀싱은 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 데 사용되는 실험실 기술입니다. Sanger 시퀀싱 및 차세대 시퀀싱은 DNA 시퀀싱의 두 가지 주요 방법입니다. 두 DNA 시퀀싱 방법 모두 특정 DNA 가닥의 뉴클레오티드 서열을 측정하기 위해 PCR에 의해 DNA 가닥에 형광 메이커의 혼입에 관여한다.

Sanger 시퀀싱

Sanger 시퀀싱으로 알려진 첫 번째 시퀀싱 방법은 1975 년 Fredric Sanger에 의해 처음 개발되었으며 결과적으로 Sanger 시퀀싱으로 알려져 있습니다. Sanger 시퀀싱은 시험 관내에서 DNA 폴리머 라제에 의해 사슬-말단 다드 옥시 뉴클레오티드 (DDNTP)의 선택적 혼입에 관여한다. DNA 합성. 따라서 체인-종료 방법이라고도합니다. 규칙적인 데 옥시 뉴클레오티드 (DNTP)는 DNA 가닥의 신장에 사용된다. DDNTP는 또한 사슬 성장의 종료를 위해 반응 혼합물에 첨가된다. 4 가지 유형의 DDNTP는 4 개의 개별 PCR 혼합물에 첨가된다. 따라서, DDATP, DDGTP, DDCTP 및 DDTTP를 추가함으로써 4 개의 개별 PCR 반응이 수행된다. 각각의 반응 혼합물에 대해, 단일 유형의 첨가 된 DDNTP (DDATP가 첨가되는 경우), 상이한 앰플 리콘의 성장은 DNA 단편의 각각의 뉴클레오티드에서 종결된다. 그런 다음 네 가지 반응을 겔 전기 영동에 의해 분리시킨다. 방출 형광은 형광계에 의해 검출된다. Sanger 시퀀싱은 DNA 클로닝에 사용 된 단편의 서열을 측정하고 PCR에 의해 증폭 된 단편의 서열을 측정하기 위해 널리 사용된다. Sanger 시퀀싱의 일반적인 절차는 그림 1 에 나와 있습니다. .

그림 1 :Sanger 시퀀싱의 일반적인 과정

차세대 시퀀싱

차세대 시퀀싱은 가장 최근의 DNA 시퀀싱 기술의 집단 이름입니다. 몇몇 시퀀싱 반응은 차세대 시퀀싱에서 칩에서 마이크로 스케일로 수행된다. 두 시퀀싱 방법 모두 PCR 동안 앰플 리콘에 혼입 된 형광과 표지 된 뉴클레오티드를 사용하여 뉴클레오티드 서열의 결정을 허용한다. 형광 마커의 체인 종단 첨가는 또한 차세대 시퀀싱에 관여합니다. 그러나, Sanger 시퀀싱과 차세대 시퀀싱의 주요 차이점은 차세대 시퀀싱에서 다르게 표지 된 앰플 리콘의 분리를위한 모세관 전기 영동의 사용이다. 모세관 전기 영동은 분자가 전기 영동 이동성에 따라 분리되는 분석적 분리 방법입니다.

DNA 시퀀싱 과정에서 PCR이 사용되는 이유

시퀀싱 중에, 형광 마커는 뉴클레오티드 서열의 결정을 위해 DNA 가닥에 통합되어야한다. 이 통합은 PCR 동안 발생합니다. 일반적으로, 4 가지 유형의 DNTP는 PCR 동안 새로 합성 DNA 가닥에 통합된다. 이 현상은 DNA 시퀀싱에 사용되어 DNA 서열을 결정하면서 형광-표지 된 디드 옥시 뉴클레오티드 (DDNTP)를 앰플 리콘에 포함시킨다.

일반적으로, 일반 4 개의 염기 (dntps; dnp; datp; datp; datp, dgtp, dctp, dttp)의 혼합물이 DNA 시퀀싱 동안 PCR 반응 혼합물에 추가됩니다.

또한, 4 개의 dideoxynucleotides (ddntp; ddatp; ddatp, ddgtp, ddctp 및 ddttp) 중 하나가 저농도에서 PCR 반응의 구성 요소로 추가됩니다. 마지막으로, 완전한 서열을 결정하기 위해 4 개의 PCR 반응이 수행되어야한다. 

그림 1 :결정된 DNA 서열

ddntps는 3'-oh 그룹 가 없습니다 들어오는 뉴클레오티드는 DNA 폴리머 라제에 의해 첨가된다. 따라서, DDNTP의 혼입은 사슬 성장을 종료한다. 따라서, 4 개의 PCR 반응 각각에서, 사슬 종결은 특정 염기에서 발생한다. 이 ddntps는 또한 다른 형광 염료와도 통합됩니다 ( ddatp에는 녹색 염료가 표시되어 있습니다. ddgtp는 노란색 염료로 표시되어 있습니다. ddctp에는 Blue 가 표시됩니다 및 ddttp에는 적색 염료 가 표시됩니다 ). 형광 염료 및 사슬 종결의 혼입은 PCR 동안 발생합니다. 앰플 리콘은 겔에서 실행되고, 뉴클레오티드 서열의 측정을 위해 자동 시퀀서의 형광계에 의해 겔이 형광에 대해 스캔된다.

결론

DNA 시퀀싱은 특정 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 데 사용되는 실험실 기술입니다. Sanger 시퀀싱 및 차세대 시퀀싱은 PCR 동안 뉴클레오티드 서열의 결정을 위해 DNA 단편에 상이한 형광 염료를 포함시킨다.

참조 :

1. Adams, Jill U.“DNA 시퀀싱 기술.” Nature News, Nature Publishing Group, 여기에서 구할 수 있습니다.
2.“Sequencing DNA - 형광 염료로 자동 시퀀싱.” Jrank 기사, 여기에서 구할 수 있습니다.

이미지 제공 :

1.“Sanger Sequencing-General”arger :user :user :fibonachi-commons wikimedia [modified] 2를 통한 Compons Wikimedia