oligo-dt/carrier 조합은 주로 친 화성 크로마토 그래피로 알려진 기술에 의해 총 RNA의 mRNA 정수에 주로 사용됩니다. 세포의 유형에 기초하여 총 RNA로부터 mRNA를 분리하는 두 가지 주요 방법이있다; 즉, mRNA 분리의 직접적인 방법 및 mRNA 분리의 마이너스 방법. 두 방법 모두이 기사에서 설명되어 있습니다.
메신저 RNA (mRNA)는 전사의 산물이며 일련의 RNA 뉴클레오티드로 구성됩니다. 그것은 단백질의 합성을 위해 핵에서 세포질로의 유전자에 정보를 전달한다. 특정 세포주로부터의 RNA 분리는 총 RNA를 초래하며, 이는 RRNA 및 TRNA와 mRNA와 함께 구성됩니다. 따라서, mRNA는 세포주의 전 사체 연구 동안 총 RNA의 혼합물로부터 분리되어야한다. mRNA 분자의 3 '말단에 폴리 (A) 꼬리의 존재와 같은 mRNA의 독특한 특성이 분리에 사용된다. oligo-dt 분자는 폴리 (a) 꼬리에 상보 적이기 때문에, mRNA는 총 RNA의 혼합물로부터 분리 될 수있다.
.주요 영역이 적용됩니다
1. mRNA
- 정의, 구조, 기능
2. 총 RNA의 구성은 무엇입니까
- mRNA, rRNA, trna
3. 총 RNA에서 mRNA를 분리하는 방법
-Oligo-DT/Carrier 분자 사용
주요 용어 :친 화성 크로마토 그래피, 메신저 RNA (mRNA), 마이너스 방법, 올리고 DT, 폴리 (A) 꼬리, 총 RNA
mRNA
mRNA는 단백질 코딩 유전자의 전 사체입니다. 그것은 진핵 생물의 핵 내부에서 생성되며 특정 단백질의 세포질로의 생성에 대한 정보를 전달합니다. 리보솜에 의해 도움을받는 번역 동안 단백질의 아미노산 서열로 번역된다. 진핵 생물의 전사에 의해 생성 된 1 차 전 사체를 pre-mRNA라고합니다.
그림 1 :mRNA 구조
전사 후 변형 중에 성숙한 mRNA 분자는 5 '캡 및 폴리 (a) 꼬리와 같은 여러 특징으로 생성됩니다. 특정 유기체의 총 mRNA는 전 사체로 알려져 있습니다.
총 RNA의 조성은 무엇입니까
RNA 분리 결과를 총 RNA라고합니다. 그것은 세포에 의해 생성 된 세 가지 주요 유형의 RNA로 구성됩니다. 그것들은 mRNA, trna 및 rRNA입니다. TRNA 및 RRNA는 모두 번역에 도움이됩니다. 진핵 생물 mRNA의 크기는 0.5-20 kb이다. 전이 RNA (TRNA)는 번역 동안 상응하는 아미노산을 가져옵니다. 그것은 76-90 염기 쌍 길이이며, 항 코돈 영역으로 구성되어 있으며, 이는 mRNA의 특정 코돈에 상보적인 것이다. 리보솜 RNA (RRNA)는 리보솜의 성분입니다. 인간 RRNA 중 일부는 5kb 길이입니다.
총 RNA의 90% 이상이 TRNA와 RRNA로 구성됩니다. 총 RNA의 1-5%만이 mRNA입니다. 전형적인 포유 동물 세포는 세포 당 대략 500,000 개의 mRNA 분자로 구성 될 수있다. 특정 유형의 mRNA의 양은 세포 당 15-20,000 카피 일 수 있습니다.
총 RNA에서 mRNA를 분리하는 방법
cDNA 라이브러리 구성, 마이크로 어레이 준비를위한 샘플 준비, 약한 발현 유전자에 대한 북부 블롯 분석 등의 많은 분자 생물학 기술은 고품질 mRNA가 필요합니다. 세포의 유형에 기초하여 총 RNA로부터 mRNA를 분리하는 두 가지 주요 방법이있다 :mRNA 분리의 직접적인 방법 및 mRNA 분리의 마이너스 방법.
.mRNA 분리의 직접 방법
진핵 생물 총 RNA로부터 성숙 mRNA의 분리의 원리는 폴리 (a) 꼬리에 상보적인 올리고 DT (올리고데 옥스 티미 디딜 레이트)를 사용하여 폴리아 데 닐화 된 mRNA의 친화력 선택/친 화성 크로마토 그래피를 포함한다. 다른 두 가지 유형의 RNA :trna 및 rRNA에 폴리 (a) 꼬리가 없을 때 가능해집니다.
mRNA는 폴리 (a) 꼬리의 30-200 아데닌 뉴클레오티드로 구성됩니다. 올리고 DT/캐리어 조합으로 채워진 친 화성 컬럼은 총 RNA로부터 mRNA의 분리에 사용된다. 올리고 DT/캐리어 조합은 셀룰로스-결합 올리고 DT, 스트렙 타비 딘-결합 된 자기 비드를 갖는 비 오티 닐화 된 올리고 DT 또는 올리고 DT- 결합 폴리스티렌 -LATEX 비드 일 수있다. 모든 실험 조건은 RNA의 효소 분해를 방지하기 위해 RNase-free 조건에 있어야합니다.
그림 2 :친 화성 크로마토 그래피
총 RNA는 높은 염 완충제에 용해되고 RNA의 2 차 구조를 방해하기 위해 65-70 ° C로 간단히 가열해야합니다. RNA의 분리 조건은 mRNA 분리를위한 시판 된 키트들 사이에서 다양하다. 그러나, 폴리 (a) -RNA 또는 mRNA의 제조는 3 단계로 구성된다.
- 폴리 (a) -RNA의 oligo dt 분자의 혼성화
- 결합되지 않은 RNA의 세척
- 낮은 엄격 성 조건 하에서 oligo-dt/carrier 조합으로부터 폴리 (a) -RNA의 용리
mRNA 분리의 마이너스 방법
mRNA의 oligo dt 기반 정제는 폴리 (a) 꼬리 또는 성숙 진핵 생물 mRNA와 mRNA를 산출합니다. 따라서, 마이너스 방법으로 알려진 다른 방법은 폴리 (a) 꼬리가없는 mRNA의 정제에 사용될 수있다. 이 방법은 효모 및 박테리아 총 RNA로부터 mRNA의 분리에 사용될 수있다. 또한 진핵 세포로부터의 성숙한 mRNA와 함께 미숙 한 유형의 mRNA의 분리에 사용될 수있다. 그것은 총 RNA에서 큰 리보솜 RNA를 고갈시킴으로써 전 사체 농축을 포함한다. Thermofisher Scientific의 Ribominus transcriptome 분리 키트는 효모 및 박테리아 총 RNA로부터 mRNA의 효율적인 정제에서 3 단계를 사용한다.
.- RRNA 서열 특이 적, 5 '비오틴-표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브와의 총 RNA의 혼성화
- 스트렙 타비 딘 코팅 자기 비드와 함께 rRNA/5'- 비 바오틴-표지 된 프로브 복합체의 제거
- 불순물의 정제와 mRNA의 용리.
결론
총 RNA는 RNA의 세 가지 주요 유형 인 mRNA, rRNA 및 trna로 구성됩니다. 총 RNA로부터 mRNA의 정제는 특정 유기체의 전 사체 분석에 필수적이다. 정제 방법은 mRNA의 유형에 기초합니다. 폴리 (a) 꼬리를 함유하는 진핵 생물 mRNA는 올리고 DT와의 친 화성 크로마토 그래피에 의해 분리 될 수있다. 효모 및 박테리아 세포로부터의 미숙 한 진핵 생물 mRNA 및 mRNA는 총 RNA에서 큰 rRNA를 고갈시켜 분리 될 수있다.
참조 :
1.“mRNA 추출.” Thermo Fisher Scientific, 여기에서 제공됩니다.
2.”RNA 유형에 의한 RNA 추출.” Thermo Fisher Scientific, 여기에서 구할 수 있습니다.
이미지 제공 :
1.“성숙한 mRNA”(CC BY-SA 3.0) Commons Wikimedia
2. English Wikibooks의 Jamit의“Affinity”-en
