단백질체학:기술, 기술 및 응용

핵심 개념

이 기사에서는 단백질 분리, 질량 분석법, 정량 기술 및 새로운 방법을 포함하여 단백질체학의 주요 기술과 기술을 검토합니다.

다른 기사에서 다루는 주제

• 단백질체학
• 질량분석기 및 질량분석기
• 단백질 서열 분석

소개

단백질체학 단백질에 대한 대규모 연구인 는 시스템 수준에서 생물학을 이해하기 위한 강력한 도구입니다. 상대적으로 일정하게 유지되는 유전자와는 달리, 단백질 발현 및 변형은 매우 역동적이고 상황에 따라 다릅니다. 단백질체학 기술의 발전으로 생물의학 연구에 혁명이 일어났고, 이를 통해 과학자들은 한 번의 실험으로 수천 개의 단백질을 식별, 정량화 및 특성화할 수 있게 되었습니다. 

이러한 방법은 질병 메커니즘을 연구하고, 바이오마커를 발견하고, 표적 치료법을 개발하는 데 중요합니다. 예를 들어, 암 연구에서 단백질체학은 진단 또는 예후 지표 역할을 할 수 있는 종양 특이적 단백질을 식별하는 데 도움이 됩니다. 의약품 개발에서는 약물 표적 검증 및 독성 스크리닝을 지원합니다. 약물 표적 검증 단백질이 질병에 직접적으로 관여하고 약물에 의해 효과적으로 표적화될 수 있음을 확인합니다. 단백질체학은 또한 단백질 프로필이 개별 분자 특성을 기반으로 치료 결정을 안내하는 맞춤형 의학에서 점점 더 많은 역할을 하고 있습니다. 

복잡한 생물학적 시스템을 탐색하고 분자적 통찰력을 실제 건강 솔루션으로 전환하려는 연구자에게는 단백질 분리, 질량 분석, 정량 전략 및 특수 방법을 포함한 단백질체학 도구를 이해하는 것이 필수적입니다.

단백질 분리 기술

단백질 분리는 샘플 복잡성을 줄이고 다운스트림 분석을 위한 샘플을 준비하기 위해 단백질체학에서 필수적입니다. 다운스트림 분석 분리 후 단백질을 식별, 정량화 또는 특성화하는 데 사용되는 기술을 의미합니다. 분리 방법에는 젤 기반 기술, 크로마토그래피, 모세관 전기영동이라는 세 가지 주요 범주가 있습니다.

1. 젤 기반 방법

SDS-PAGE와 같은 젤 기반 방법 , 크기별로 단백질을 분리합니다. SDS-PAGE에서 SDS(나트륨 도데실 황산염)는 단백질을 균일한 음전하로 코팅하여 겔 매트릭스를 통해 크기 기반 이동을 허용합니다. SDS 단백질을 변성시키고 모양과 전하의 차이를 없애는 세제입니다. 균일한 음전하로 인해 단백질 크기만을 기준으로 분리가 이루어집니다. 이는 중소형 단백질에는 간단하고 효과적이지만, 대형 또는 소수성 단백질에는 어려움을 겪습니다. 큰 단백질은 조밀한 겔 매트릭스를 통해 천천히 이동하며 소수성 단백질은 SDS 결합에 응집되거나 저항할 수 있습니다.

2차원 겔 전기영동 (2D-GE )는 크기뿐만 아니라 등전점에 따라 단백질을 분리하기 때문에 이 기술을 한 단계 더 발전시킵니다. 단백질의 등전점 (피I )는 전하 환경을 나타내므로 유사한 단백질을 구별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이를 통해 복잡한 혼합물의 분해능이 향상됩니다. 그러나 시간이 많이 걸리며 모든 단백질 유형에 이상적인 것은 아닙니다.

2. 크로마토그래피 및 모세관 전기영동

다행스럽게도 크로마토그래피 기반 방법은 더 많은 유연성을 제공합니다. 크로마토그래피에는 여러 유형이 있으며, 연구자들은 단백질에 대해 알고 싶은 특성에 따라 어떤 유형을 사용할지 결정합니다. 예를 들어 친화성 크로마토그래피 항체 또는 태그가 붙은 단백질과 같은 특정 결합 상호 작용을 사용하여 단백질을 분리합니다. 이 방법은 선택성이 매우 높지만 대상에 대한 사전 지식이 필요합니다. 이온 교환 크로마토그래피 전하 차이를 기준으로 단백질을 분리하며 혼합물을 분류하는 데 유용합니다. 크기 배제 크로마토그래피 분자 크기에 따라 분리되어 단백질 구조를 보존하지만 비슷한 크기의 분자에 대한 분해능은 제한적입니다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC ) 소수성으로 구분됩니다. 이는 질량분석법을 위한 펩타이드를 준비하는 데 자주 사용되며, 이 기술에 대해서는 곧 더 자세히 논의하겠습니다.

또 다른 분리 기술인 모세관 전기영동 , 좁은 모세관 내의 전하 대 크기 비율을 기준으로 단백질이나 펩타이드를 분리합니다. 이는 매우 효율적이고 작은 샘플량을 사용하며(따라서 자원을 절약함) 질량 분석기 내에서 잘 작동합니다. 젤이나 크로마토그래피에 비해 덜 일반적으로 사용되지만 빠른 고해상도 분석으로 주목을 받고 있습니다. 크기 대비 청구 비율 이는 분리 중에 분자가 얼마나 빨리 움직이는지를 결정하기 때문에 중요합니다. 이 움직임은 구조, 이온화 ​​및 구조적 특성에 대한 통찰력을 제공합니다. 젤과 크로마토그래피는 작동이 더 간단하고 실험실에서 널리 사용 가능하며 대용량 샘플에 더 적합하기 때문에 더 일반적으로 사용됩니다. 반면, 모세관 전기영동에는 보다 전문적인 장비와 전문 지식이 필요한 경우가 많습니다.

단백질체학의 질량분석기

질량 분석 (MS )은 단백질체학의 핵심입니다. 전하 질량을 기반으로 단백질을 식별하고 정량화합니다. (m /z ) 비율 이온화된 분자의 MS는 복잡한 단백질 혼합물을 민감하게 분석할 수 있어 대규모 단백질체 프로파일링에 이상적입니다.

이온화는 MS의 첫 번째 단계로, 단백질이나 펩타이드를 기체상 이온으로 전환합니다. 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 (말디 )는 레이저를 사용하여 결정질 매트릭스에 내장된 펩타이드를 이온화합니다. 속도가 빠르고 염분에 잘 견디며 이미징이나 간단한 혼합에 자주 사용됩니다. MALDI는 대부분의 단일 전하 이온을 생성하므로 복잡한 시료의 직렬 MS 분석에는 적합하지 않습니다. 전기분무 이온화 (ESI )는 액체 시료에 고전압을 가하여 이온을 생성하여 하전된 액적을 형성합니다. MALDI와 달리 ESI는 다중 하전 이온을 생성하므로 대규모 생체분자를 분석하는 데 이상적입니다. 이는 일반적으로 액체 크로마토그래피와 결합됩니다. (LC ) 복잡한 펩타이드 혼합물을 분석하기 위한 것입니다. ESI와 LC를 함께 사용하면 감도와 분리가 향상되어 복잡한 생물학적 시료에서 미량의 펩타이드를 검출할 수 있습니다.

질량 분석기 및 직렬 질량 분석법

질량 분석기 m을 기준으로 이온 분리 /z 가치. 각각은 해상도, 속도, 정확성 면에서 강점을 갖고 있습니다. 비행 시간 (TOF )는 이온이 특정 거리를 이동하는 데 걸리는 시간을 측정합니다. 가벼운 이온은 무거운 이온보다 이 거리를 더 빠르게(더 짧은 TOF) 이동하므로 TOF는 이온의 질량과 전하에 대한 통찰력을 제공합니다. TOF는 높은 처리량 및 MALDI에 적합합니다.

또 다른 유형의 질량 분석기인 사중극자 , 진동 전기장을 통해 이온을 필터링하며, 표적 MS에 유용합니다. 오비트랩 높은 분해능과 질량 정확도를 제공하므로 복잡한 단백질체학에 이상적입니다. 이온 트랩 이온을 포착하고 순차적으로 배출합니다. MS/MS(자세한 내용은 다음에 설명) 및 작은 샘플 크기에 유용하지만 Orbitrap 또는 TOF에 비해 분해능이 낮고 질량 범위가 제한됩니다. 최신 장비는 더 나은 성능을 위해 Quadrupole-Orbitrap 또는 Q-TOF와 같은 분석기를 결합하는 경우가 많습니다.

탠덤 질량 분석기 (MS/MS )에는 여러 차례의 질량 분석이 포함됩니다. MS/MS에서 펩타이드 이온(전구체 이온 )이 선택된 다음 조각화됩니다. 조각난 이온을 분석하여 펩타이드의 아미노산 서열을 추론합니다. 일반적인 조각화 방법에는 충돌로 인한 해리가 포함됩니다. (CID ) 및 고에너지 충돌 해리 (HCD ). MS/MS는 펩타이드 단편에서 알려지지 않은 단백질을 식별하는 데 필수적입니다.

하향식 대 상향식 단백질체학

하향식 단백질체학 소화 없이 손상되지 않은 단백질을 분석합니다. 번역 후 수정은 유지되지만 (PTM ) 및 isoform 정보는 기술적으로 더 까다롭습니다. 고해상도 기기가 필요하며 복잡성이 낮은 샘플에 가장 적합합니다.

상향식 단백질체학 MS 분석 전에 단백질을 펩타이드로 분해합니다. 높은 감도와 처리량으로 인해 가장 널리 사용되는 접근 방식입니다. 그러나 PTM 또는 isoform에 대한 정보가 손실될 수 있습니다. 

정량적 단백질체학 기술

정량적 단백질체학은 샘플 간 풍부도의 차이를 측정합니다. 생물학적 변화, 질병 상태 및 약물 반응을 연구하는 데 필수적입니다. 동위원소 표지화, 비표지 정량화, 표적 정량화의 세 가지 주요 전략이 있습니다. 

동위원소 라벨링 이 방법은 안정한 동위원소를 단백질이나 펩타이드에 도입하여 질량 이동을 기반으로 한 샘플 간의 비교를 가능하게 합니다. 대규모 이동 더 무거운 동위원소를 통합함으로써 발생하는 감지 가능한 분자량 변화입니다. 세포 배양 내 아미노산에 의한 안정 동위원소 표지 (SILAC ) "가벼운" 또는 "무거운" 아미노산을 사용하여 세포 성장 중에 단백질에 라벨을 붙입니다. 가벼운 아미노산에는 일반적인 동위원소가 포함되어 있고, 무거운 아미노산에는 안정하고 무거운 동위원소가 포함되어 있습니다. 레이블이 지정된 셀은 처리 전에 결합되어 변동성을 줄입니다. 이는 다양한 조건에서 세포 단백질체학을 비교하는 데 이상적입니다. 예를 들어 실험 그룹에서는 무거운 아미노산을 사용하고 대조군에서는 가벼운 아미노산을 사용합니다. SILAC는 세포 배양 시스템으로 제한되며 조직이나 생체액에는 적용할 수 없습니다. 

동위원소로 코딩된 친화성 태그 (ICAT ) 가볍거나 무거운 화학적 태그가 있는 시스테인 잔기를 표적으로 삼습니다. 라벨링 후 단백질은 소화되고, 라벨링된 펩타이드는 MS 분석을 위해 농축됩니다. 이 농축에는 친화성 크로마토그래피를 사용하여 태그가 지정된 펩타이드를 분리하는 작업이 포함되어 있어 시료의 복잡성을 줄이고 검출 감도를 향상시키는 데 도움이 됩니다. ICAT는 복잡성을 줄였지만 시스테인이 없는 단백질을 놓치고 부분적인 프로테옴 적용 범위만 제공합니다. 이를 보완하기 위해 보완 기술이나 라벨링 방법(예:다음에 설명할 TMT 또는 iTRAQ)을 사용하여 시스테인이 포함되지 않은 단백질을 검출할 수 있습니다. 이러한 방법은 ICAT와 함께 사용하여 더 넓은 프로테옴 적용 범위를 달성할 수 있습니다.

등압 태깅(TMT 및 iTRAQ)

탠덤 대량 태그 (TMT ) 및 상대 및 절대 정량을 위한 등압 태그 (iTRAQ ) 동일한 질량의 태그를 사용하여 다양한 샘플의 펩타이드에 라벨을 붙입니다. MS/MS 중에 리포터 이온이 방출되어 정량화됩니다. 이러한 방법은 다중화를 허용하고 높은 처리량을 제공하지만 이온의 동시 분리로 인해 비율 왜곡이 발생할 수 있습니다. 공동격리 여러 펩타이드가 단편화를 위해 함께 선택되어 혼합 리포터 이온 신호가 발생할 때 발생합니다. 이러한 혼합은 실제 신호를 오염시키고 샘플 간에 측정된 존재비를 왜곡시킵니다.

라벨 없는 방법은 화학적 라벨을 사용하지 않고 MS 데이터에서 직접 펩타이드 또는 단백질 존재비를 측정합니다. 두 가지 주요 접근 방식은 스펙트럼 계산과 MS1입니다. 스펙트럼 계산 각 단백질에 할당된 MS/MS 스펙트럼 수를 계산하여 단백질 존재도를 추정합니다. 간단하고 확장 가능하지만 단백질 함량이 낮고 동적 범위가 좁은 경우 정확도가 제한됩니다. 동적 범위 샘플에서 가장 낮은 단백질 존재비와 가장 높은 단백질 존재비 사이의 범위를 나타냅니다. MS1 강도 기반 정량화 스캔의 크로마토그래피 피크에서 펩타이드 이온 신호 강도를 측정합니다. 이 방법은 스펙트럼 계산보다 더 높은 정밀도를 제공하며 복잡한 샘플에 잘 작동합니다. 그러나 샘플의 정확한 비교를 보장하려면 일관된 크로마토그래피와 세심한 머무름 시간 정렬이 필요합니다. 보존 시간 기기가 펩타이드를 감지하고 측정하기 전에 펩타이드가 크로마토그래피 컬럼을 통과하는 데 걸리는 시간입니다.

특화 및 최신 기술 단백질체학

단일 세포 단백질체학 개별 세포의 단백질 발현을 분석하여 대량 분석에서 종종 가려지는 이질성을 드러냅니다. 초고감도 MS 기술과 시료 준비 방법을 사용하여 최소한의 입력으로 소량의 단백질을 검출합니다. 이 기술은 세포 특이적 신호 전달 및 단백질 발현 패턴을 프로파일링하여 암 연구, 발생 생물학 및 면역학에 사용됩니다. 

인단백질체학 세포 신호 전달 및 기능의 주요 조절 인자인 인산화 단백질을 식별하고 정량화하는 데 중점을 둡니다. 고정화 금속 친화성 크로마토그래피와 같은 농축 방법 (IMAC ), MS 분석 전에 포스포펩타이드를 분리합니다. 이 방법은 질병과 관련된 키나제 활성, 신호 전달 경로 및 조절 네트워크를 밝혀내는 데 도움이 됩니다. 

당단백체학 세포 의사소통, 면역 및 단백질 안정성에 중요한 당화된 단백질을 표적으로 합니다. 당화 부위 및 구조를 분석하기 위해 농축 전략과 MS를 사용함으로써 당단백체 분석은 암, 염증 및 선천성 장애와 관련된 변화를 밝혀냅니다.

기본 질량 분석법 (기본 MS )는 비공유 상호작용을 보존하면서 변성 없이 손상되지 않은 단백질 복합체를 분석합니다. 이는 화학양론, 구조 역학 및 단백질-단백질 상호 작용에 대한 정보를 제공합니다. 기본 MS는 저온 EM 및 NMR과 같은 구조 생물학 방법을 보완하여 생리학적 조건에 가까운 단백질 구조에 대한 통찰력을 제공합니다. 극저온 전자현미경 (cryo-EM )는 원래 상태로 동결된 단백질의 고해상도 3D 구조를 포착합니다. 기본 MS는 질량과 결합 상호작용을 보여주고, cryo-EM은 전체적인 모양을 보여주며, NMR은 원자 수준의 역학을 감지합니다. 이러한 기술을 결합함으로써 연구자들은 생물학적으로 관련된 조건에서 단백질 거동을 보다 완벽하게 파악할 수 있습니다. 생리학적 조건에 가까운 발견은 질병 유도 약물 개발 중에 단백질 구조나 상호 작용이 어떻게 변할 수 있는지 모델링하는 데 도움이 될 수 있습니다.

결론

단백질체학 기술은 생물학에 대한 이해를 높이는 것뿐만 아니라 의료 및 그 이상 분야의 혁신을 주도하는 데에도 필수적입니다. 이러한 방법은 정밀한 대규모 단백질 분석을 가능하게 함으로써 조기 약물 검출, 맞춤형 치료 전략 및 보다 효과적인 약물 개발을 지원합니다. 이들의 영향은 농업, 환경 모니터링, 생명공학 등 다른 산업으로도 확장됩니다. 기술이 계속 발전함에 따라 단백질체학은 시스템 생물학, 임상 진단, 합성 생물학 및 정밀 영양과 같은 신흥 분야에서 훨씬 더 큰 역할을 할 수 있는 위치에 있습니다.