식물성 선충은 식물의 뿌리를 감염시켜 전 세계적으로 수십억 달러의 농작물 손실을 초래합니다. 그러한 예 중 하나는 콩 낭종 선충 (SCN)이며, 이는 북아메리카에서 가장 손상된 대두 병원체입니다. 토양에서 선충 알의 인구 밀도 (수)를 아는 것은 해충의 탐지, 모니터링 및 효과적인 관리에 중요합니다.
필드에 존재하는 난 밀도를 결정하기 위해, 토양 샘플은 필드에서 수집되고 선충 낭종 (계란으로 채워진 죽은 암컷)은 습한 체질 및 디 캔팅 또는 용리화 방법을 사용하여 토양에서 회수된다. 이어서, 선충 낭종이 파열되어 계란 크기의 잔해물과 함께 체에 포착 된 알을 방출합니다. 전통적으로, 잔해는 자당 원심 분리를 사용하여 계란 현탁액에서 제거 된 다음, 계란을 염색하고 현미경으로 시각적으로 계산하여 토양 샘플에서 알의 인구 밀도를 추정합니다.
.문제는 전통적인 계란 서스펜션 청소 및 계산 단계의 대부분이 수동으로 수행되며 시간 집약적이고 힘들어 처리 시간과 처리량을 제한한다는 것입니다. 제한된 수의 토양 샘플을 주어진 날에 추출하고 분석 할 수 있습니다. 그리고 자당은 저렴하지만 자당 원심 분리는 잔해물을 완전히 제거하지 않아 계란을 계산하기가 어렵습니다. 또한, 수 크로스 잔기는 원심 분리 후 계란 표면에 남아있을 수 있으며, 저장 될 때 샘플에서 오염 된 곰팡이 및 박테리아의 성장을 촉진합니다. 자동 계란 계산이 포함 된 더 나은 계란 샘플 세정 과정이 필요했습니다.
우리는 Sucrose 대신 밀도 그라디언트 매체로서 Optipreptm을 사용하여 계란 샘플 청소 프로토콜을 개발했습니다. 이를 위해 습식 체 및 디 캔팅을 사용하여 토양 샘플에서 알과 잔해물을 추출했습니다. 이어서 알을 염색하여 잔해 사이의 시각화를 개선시켰다. 계란 현탁액을 Optiprep과 혼합하고, 15 mL 시험관에 넣고, 840g에서 2 분 동안 원심 분리 하였다. 원심 분리 후, 대부분의 선충 알은 계면 에멀젼 층에서 수집되었으며, 더 무거운 잔해 입자는 튜브의 바닥에 침착된다. 우리는 최상의 샘플 정제를 얻기 위해 적절한 농도의 Optiprep을 결정했습니다.
계란 계산을 자동화하기 위해, 정제 된 염색 된 계란 샘플을 필터 용지에 뿌려 고해상도 스캐너로 스캔 하였다. 스캔 된 이미지를 통해 검색하여 샘플에서 선충 알을 식별하고 계산하기 위해 컨볼 루션 autoencoder 네트워크를 사용한 심층 학습 아키텍처. 선충 알을 계산하는 대안적인 방법은 렌즈리스 이미징으로 미세 유체 칩을 통해 계란 현탁액을 흐르면 개발되었습니다. 계란과 잔해가 흐름 칩을 통과함에 따라 통과 된 물체의 홀로그램 비디오가 생성되어 저장되었습니다. 홀로그램 비디오를 재구성함으로써 소프트웨어는 선충 알을 인식하고 (염색 없이도) 샘플에서 총 알 수를 계속 유지할 수있었습니다.
새로운 샘플 청소 및 이미징 방법의 성능을 테스트하기 위해 아이오와 주 Iowa State University Research Farms의 두 분야에서 토양 샘플을 수집하여 SCN에 감염되었습니다. 토양 샘플에서 추출한 계란 현탁액을 자당 원심 분리 및 새로운 optiprep 방법으로 세척 하였다. 이어서, 계란 제제를 염색하고 현미경으로 수동으로 계산하고 우리가 개발 한 두 가지 새로운 이미징 방법으로 계산 하였다. 방법으로부터 샘플과 계란 수의 잔해물의 양을 비교했다.
샘플 세정에 Optiprep의 사용은 자당 원심 분리 (<40%)의 사용과 비교하여 난 회복 (> 80%)을 상당히 향상시켰다. 그리고 두 자동 계란 계산 방법으로부터 얻은 결과는 직접 현미경 관찰로부터 계란 수와 높은 상관 관계가 있었다. 우리의 자동 계란 계산 방법은 샘플 준비 및 하중 중에 만 최소한의 인간 개입이 필요했습니다. 이 소프트웨어는 광범위한 계란 수 (ml 당 10 ~ 300 개의 알)에 걸쳐 나머지 작업을 처리했습니다. 하드웨어의 비용은 기성품 구성 요소, 접착제 테이프 및 표준 필터 용지를 사용하여 Nematology Laboratories의 광범위한 채택을 위해 의도적으로 낮게 유지되었습니다.
