부위 지향적 돌연변이 유발 (SDM)은 시험관 내 입니다 알려진 서열에서 돌연변이를 생성하는 방법. 종종 PCR 기반 방법에 의해 수행됩니다. 전형적으로, 하나 또는 두 개의 염기는 부위 지향적 돌연변이 유발로 변경된다. 프라이머는 뉴클레오티드 서열에 작은 변화를 도입하기 위해 원하는 돌연변이로 설계 될 수있다. 프라이머 연장 및 역 PCR을 사용하여 대규모 돌연변이를 도입 할 수 있습니다. 이 접근법은 특정 단백질의 아미노산 조성을 변화시킬 수 있습니다. 부위 지향적 돌연변이 유발은 단백질의 활성의 변화를 연구하는데 사용된다. 또한 퓨전 단백질을 만드는 데 사용됩니다.
주요 영역이 적용됩니다
1. 부위 지향적 돌연변이 유발 (SDM)
- 정의, 역할, 방법
2. 부위 지향적 돌연변이 유발을위한 프라이머를 설계하는 방법
- 대체, 삭제, 삽입
주요 용어 :결실, 삽입, 돌연변이, 부위 지향적 돌연변이 유발, 대체, 전통적인 PCR
부위 지향적 돌연변이 유발이란?
부위 지향적 돌연변이 유발은 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대한 특정 변화를 도입하는데 사용되는 분자 생물학 기술이다. 단백질의 아미노산 서열을 변화시키고, 제한 부위를 도입하거나 제거하고, 전사 결합 부위를 파괴하고, 융합 단백질을 생성하는 데 사용됩니다.
.프로세스
부위 지향적 돌연변이 유발 중에, 돌연변이는 원하는 돌연변이로 구성된 프라이머를 사용하여 플라스미드에 도입된다. 전체 주형은 PCR에 의해 증폭되어 돌연변이를 주형에 통합시킨다. 이어서,, 효소, 메틸화-의존적 엔도 뉴 클레아 제를 사용하여 모 템플릿을 샘플에서 제거한다. 원하는 돌연변이를 갖는 PCR 생성물 또는 닉한 플라스미드 분자는 박테리아로 변환된다. 플라스미드는 원하는 변형으로 박테리아로부터 분리 될 수있다. 부위 지향 돌연변이 유발 과정은도 1 에 도시되어있다. .
그림 1 :부위 지향적 돌연변이 유발
세 가지 주요 유형의 방법은 사이트 지향적 돌연변이 유발에 원하는 돌연변이를 도입하는 데 사용됩니다. 그것들은 전통적인 PCR, 프라이머 확장 및 역 PCR입니다. 프라이머 연장 및 역 PCR은 대규모 뉴클레오티드 변화를 도입하는 데 사용될 수 있습니다.
전통적인 PCR
전통적인 PCR을 사용하여 변형 된 프라이머로 표적 서열에 하나 또는 두 개의 뉴클레오티드 변화를 도입 할 수 있습니다. 변화는 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 첨가 일 수 있습니다. 돌연변이는 PCR 동안 앰플 리콘에 통합된다. 따라서 원래 서열은 프라이머의 돌연변이 서열로 대체됩니다.
프라이머 확장
프라이머 확장에서 원하는 돌연변이는 중첩 된 PCR 동안 통합됩니다. 여기서, 표적 시퀀스는 2 개의 프라이머에 의해 측면이다. 원하는 돌연변이는 내부 프라이머에 통합되고, 돌연변이는 두 번째 PCR 라운드에 도입된다. 일반적으로, PCR 반응의 특이성은 프라이머에서 불일치 된 뉴클레오티드의 증가에 따라 감소한다. 그러나, 중첩 된 PCR이 PCR 반응의 특이성을 증가시킬 수 있기 때문에 대규모 돌연변이를 갖는 긴 내부 프라이머는 프라이머 확장에 사용될 수있다.
역 PCR
역 PCR은 알려진 DNA 서열에 프라이머를 설계함으로써 알려지지 않은 DNA 단편을 증폭시키는 방법입니다. 뉴클레오티드를 대규모로 대체, 삭제 또는 삽입하는 데 사용될 수 있습니다.
부위 지향 돌연변이 유발의 적용은 다음과 같습니다.
- 단백질의 구조, 기능 및 촉매 특성을 연구하려면
- 단백질의 특성을 개선하기 위해 (단백질 공학)
- 제한 endonucleases 사이트를 도입하거나 제거하려면
부위 지향적 돌연변이 유발을위한 프라이머를 설계하는 방법
부위 지향적 돌연변이 유발은 프라이머를 통해 원하는 돌연변이를 도입하는 과정입니다. 돌연변이는 치환, 삽입 또는 결실 일 수있다. 프라이머에서 PCR의 특이성이 증가함에 따라 증가함에 따라 감소함에 따라, 전통적인 PCR은 표적 서열에 대한 하나 또는 두 개의 염기 쌍 변화 만 유발할 수있다. 프라이머 확장 및 역 PCR과 같은 다른 방법을 사용하여 대규모 돌연변이를 도입 할 수 있습니다. 부위 지향 돌연변이 유발의 프라이머 설계는도 2 에 도시되어있다. .
그림 2 :부위 지향적 돌연변이 유발을위한 프라이머
치환
치환의 경우, 두 프라이머 중 하나는 프라이머 중간에 원하는 돌연변이를 포함해야합니다. 여기서, 돌연변이를 포함하는 부위는 왜곡을 형성하기 때문에 표적 서열에 어닐링되지 않습니다.
삭제
삭제의 경우 프라이머 설계 중에 대상에서 삭제 될 시퀀스를 무시할 수 있습니다. 이 시퀀스는 프라이머에 의해 측면 영역을 제외하고, PCR 동안 증폭되지 않을 것이다.
.삽입
삽입의 경우, 추가 할 시퀀스는 프라이머 설계 동안 프라이머 중 하나의 5 '끝에 얽혀 있습니다. 따라서 삽입 된 시퀀스는 앰플 리콘에도 부착 된 상태로 유지 될 수 있습니다.
결론
부위 지향적 돌연변이 유발은 돌연변이를 DNA 서열에 도입하는 데 사용되는 기술입니다. 이들 돌연변이는 치환, 삽입 또는 결실 일 수있다. 소규모 돌연변이는 전통적인 PCR에 도입 될 수있다. 대규모 돌연변이는 프라이머 연장 또는 역 PCR에 도입 될 수있다. 돌연변이의 도입은 원하는 돌연변이를 프라이머에 통합함으로써 수행된다.
참조 :
1.“부위 지향적 돌연변이 유발 방법.” 통합 DNA 기술 , 여기에서 사용할 수 있습니다.
이미지 제공 :
1. Knbusby의“Site Difrated Mutagenesis” - Commons Wikimedia를 통한 자신의 작업 (공개 도메인)
