DNA 시퀀싱은 특정 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 데 도움이되는 기술입니다. 시퀀싱의 두 가지 방법은 Sanger 시퀀싱 및 차세대 시퀀싱입니다. 두 유형의 시퀀싱 방법은 최신 상태로 완전히 자동화됩니다. 임의의 DNA 가닥은 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C) 및 티민 (T)의 4 가지 뉴클레오티드로 구성된다. DNA 단편의 뉴클레오티드는 두 가지 유형의 시퀀싱 방법에서 4 개의 개별 형광 마커로 표지됩니다. 형광 마커 또는 형광 단은 빛을 흡수하고 잘 정의 된 파장에서 방출 할 수있는 분자이다. 형광 마커는 PCR에 의해 DNA 가닥에 통합된다. 그런 다음 뉴클레오티드의 서열은 자동화 된 기술에 의해 결정됩니다.
주요 영역이 적용됩니다
1. 시퀀싱이란 무엇입니까
-정의, Sanger 시퀀싱, 차세대 시퀀싱
2. 형광 마커가 뉴클레오티드 서열을 결정하는 데 어떻게 도움이됩니까
- 시퀀싱 절차
주요 용어 :Dideoxynucleotides (DDNTP), 형광 마커, 겔 전기 영동, 차세대 시퀀싱, 뉴클레오티드 서열, PCR, Sanger 시퀀싱
시퀀싱이란 무엇입니까
시퀀싱은 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 데 사용되는 실험실 기술입니다. DNA 시퀀싱 방법의 두 가지 주요 유형은 Sanger 시퀀싱 및 차세대 시퀀싱으로 식별 될 수 있습니다. Sanger 시퀀싱 및 차세대 시퀀싱은 뉴클레오티드 서열의 측정을 위해 형광과 함께 표지 된 뉴클레오티드를 사용한다.
Sanger 시퀀싱
Sanger 시퀀싱은 DNA 시퀀싱의 최초 개발 방법입니다. 시퀀싱 방법은 1975 년 Fredric Sanger에 의해 처음 개발되었으며 결과적으로 Sanger 시퀀싱으로 알려져 있습니다. Sanger 시퀀싱 방법은 체인 종료 방법 라고도합니다. 시험 관내 동안 DNA 폴리머 라제에 의해 사슬-말단 다드 옥시 뉴클레오티드 (DDNTP)의 선택적 혼입에 관여함에 따라. DNA 합성. DNA 가닥의 신장은 일반 데 옥시 뉴클레오티드 (DNTP)에 의해 달성된다. 그러나, DDNTP를 반응 혼합물에 첨가하여 사슬 성장을 종료한다. 이들 DDNTP는 형광등으로 변형된다. 4 가지 유형의 DDNTP는 4 개의 개별 PCR 혼합물에 첨가된다. 따라서, DDATP, DDGTP, DDCTP 및 DDTTP를 추가함으로써 4 개의 개별 PCR 반응이 수행된다. 각각의 반응 혼합물에서, 사슬 성장은 각각 각각의 A, G, C 및 T 뉴클레오티드에서 종결된다. 예를 들어, 첨가 된 DDATP와 반응 혼합물에서, 상이한 앰플 리콘의 성장은 DNA 단편의 각 뉴클레오티드에서 종결된다. 이어서, 이들 4 가지 반응은 겔 전기 영동에 의해 분리되고, 형광 계는 별도의 형광을 스캔하는데 사용된다. Sanger 시퀀싱은 DNA 클로닝에 사용 된 단편의 서열을 측정하고 PCR에 의해 증폭 된 단편의 서열을 측정하기 위해 널리 사용된다. 결정된 뉴클레오티드 서열은도 1. 에 도시되어있다
그림 1 :DNA 서열
차세대 시퀀싱
가장 최근의 DNA 시퀀싱 기술은 차세대 시퀀싱으로 공동으로 알려져 있습니다. 시퀀싱 반응은 한 번에 칩에서 마이크로 스케일로 수행된다. 따라서, 여러 시퀀싱 반응이 동시에 수행된다. 차세대 시퀀싱에서, 모세관 전기 영동은 체인 종료 방법에 의해 생성 된 다양한 길이를 갖는 amlicon의 분리를위한 겔 전기 영동 외에도 사용된다. 모세관 전기 영동은 전기 영동 이동성에 따라 분자가 분리되는 분석적 분리 방법입니다.
형광 제조업체가 뉴클레오티드 서열을 결정하는 데 어떻게 도움이됩니까
시퀀싱 중에 시퀀싱 될 DNA는 PCR에 의한 DNA 합성을위한 주형 가닥으로서 작용한다. DNA 프라이머는 DNA 폴리머 라제에 의한 DNA 합성의 개시에 사용된다. 규칙적인 4 개의 염기 (DNTP; DATP, DATP, DGTP, DCTP, DTTP) 및 4 개의 Dideoxynucleotides (DDTP; DDATP, DDGTP, DDCTP 및 DDTTP)의 낮은 수준이 PCR 반응의 성분으로 첨가된다. 따라서, 4 개의 DDNTP 각각을 첨가함으로써 4 개의 개별 PCR 반응이 수행된다. Dideoxynucleotides는 두 가지 특성을 가지고 있습니다 :
- 그것들은 DNA 폴리머 라제에 의해 들어오는 뉴클레오티드가 첨가되는 3'-OH 그룹이 부족합니다. 따라서 DDNTP의 통합은 체인 성장을 종료합니다.
- 그들은 다른 형광 염료로 표시되어 있습니다. , ddgtp에는 노란색 염료 가 표시되어 있습니다 , ddctp에는 Blue 가 표시됩니다 및 ddttp에는 적색 염료 가 표시됩니다 .
그러나 쇄 다른 DDNTPS는 저농도로 추가됩니다. 그들은 한 번에 전체 PCR 프로세스를 종료하지 않습니다. 그러나 4 개의 DDNTP 중 하나가 성장 체인에 통합 될 때, 그 특정 사슬 성장은 종료됩니다. 따라서, 각각의 4 개의 PCR 반응의 끝에서, 일련의 앰플 리콘 (PCR에 의한 결과 DNA 단편)이 생성되며, 이는 표적 DNA 단편의 각 뉴클레오티드에서 종결된다. . 이 앰플 리콘은 젤로 실행할 수 있습니다. 전기 영동 겔의 정의 된 지점에서 통과하는 형광 염료는 자동화 된 DNA 시퀀서에서 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해 형광 계로 스캔 할 수 있습니다. DNA 시퀀싱에서 수득 된 형광-표지 된 뉴클레오티드 서열은도 2 에 도시되어있다. .
그림 2 :형광-표지 된 뉴클레오티드 서열
시리즈에서 각 뉴클레오티드를 결합하여 초기 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있습니다. 750-1,000베이스 쌍을 갖는 단편의 뉴클레오티드 서열은 Sanger 시퀀싱에 의해 실행 당 쉽게 결정될 수있다. 그러나, 전체 게놈의 시퀀싱은 다수의 뉴클레오티드의 존재로 인해 여전히 도전적으로 남아있다. 454 시퀀싱은 단일 실행 당 2 천만 개의베이스 쌍을 읽을 수있는 차세대 시퀀싱 유형입니다.
결론
시퀀싱은 특정 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 데 사용되는 기술입니다. Sanger 시퀀싱 및 차세대 시퀀싱은 두 가지 주요 시퀀싱 기술입니다. 두 기술 모두 뉴클레오티드 서열의 결정을 위해 형광 마커를 사용합니다. 4 개의 사슬-말단 디드 옥시 뉴클레오티드 각각은 4 개의 상이한 형광 염료로 표지되며, 4 개의 별도의 PCR 반응에 사용되어 서열을 얻습니다.
.참조 :
1. Adams, Jill U.“DNA 시퀀싱 기술.” Nature News, Nature Publishing Group, 여기에서 제공됩니다.
2. Carr, Steven M. 형광 시퀀싱,
3.“시퀀싱 DNA - 형광 염료를 사용한 자동 시퀀싱.” Jrank 기사, 여기에서 구할 수 있습니다.
이미지 제공 :
1. Flickr
2를 통해 Shaury Nash (CC By-SA 2.0)의“Alineando Secuencias (2)”. Wikimedia
