시퀀싱은 특정 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열의 결정에 관여하는 과정입니다. 시퀀싱 동안, DNA 단편은 PCR에 의해 형광-표지 된 뉴클레오티드로 말단으로 표지된다. 이 과정은 4 가지 유형의 형광-표지 된 뉴클레오티드를 사용하며, 이들은 Dideoxynucleotides (DDNTP)입니다. DDNTP는 들어오는 뉴클레오티드의 포스페이트 그룹이 부착 된 3 'OH 그룹이 없다. 따라서, DDNTP가 성장 사슬에 첨가 될 때, 사슬의 3 '말단에 더 이상 뉴클레오티드를 첨가하지 않을 것이다. 이는 성장하는 체인에 DDNTP를 추가하면 사슬 성장이 종료됩니다. DDNTP는 저농도로 PCR 혼합물에 첨가되기 때문에, 각각의 성장 사슬은 상이한 수준으로 종결된다. 방출 형광은 PCR의 끝에서 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해 검출된다.
.주요 영역이 적용됩니다
1. DNA 시퀀싱이란 무엇입니까
- 정의, 유형
2. DNA 시퀀싱은 어떻게 작동합니까
- DNA 시퀀싱 과정
주요 용어 :Dideoxynucleotides (DDNTP), 형광 마커, 겔 전기 영동, 차세대 시퀀싱, 뉴클레오티드 서열, PCR, Sanger 시퀀싱
DNA 시퀀싱이란 무엇입니까
DNA 시퀀싱은 특정 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 결정에 사용되는 실험실 기술입니다. 그것은 PCR 동안 혼입 된 형광-표지 된 뉴클레오티드를 사용한다. 형광 검출에 사용 된 기술에 기초한 두 가지 주요 시퀀싱 방법 :Sanger 시퀀싱 및 차세대 시퀀싱.
Sanger 시퀀싱
1975 년 Fredric Sanger가 개발 한 Sanger Sequencing은 최초의 개발 된 시퀀싱 방법입니다. 연쇄 종결 방법 라고도합니다 이후 그것은 시험 관내에서 동안 사슬 말단 DDNTP의 선택적 혼입에 관여한다. DNA 합성. Sanger 시퀀싱에서, 앰플 리콘은 겔 전기 영동에 의해 분리된다. Sanger 시퀀싱은 클로닝에 사용 된 DNA 단편의 서열의 측정 및 PCR에 의해 증폭 된 단편의 서열을 측정하기 위해 널리 사용된다. 결정된 DNA 서열은도 1에 도시되어있다
그림 1 :DNA 시퀀싱
차세대 시퀀싱
가장 최근의 DNA 시퀀싱 기술은 차세대 시퀀싱으로 공동으로 알려져 있습니다. 또한 체인 종료 방법입니다. 차세대 시퀀싱은 체인 종료 방법에 의해 생성 된 다양한 길이를 갖는 앰플 리콘의 분리를 위해 모세관 전기 영동을 사용합니다. 차세대 시퀀싱은 게놈 시퀀싱과 같은 런당 다수의 뉴클레오티드를 측정하는 데 사용됩니다.
DNA 시퀀싱은 어떻게 작동합니까
DNA 시퀀싱 중에, 형광-표지 된 뉴클레오티드는 PCR에 의해 특정 DNA 단편에 첨가된다. DNA 가닥의 신장을 위해, 규칙적인 데 옥시 뉴클레오티드 (DNTP)가 사용된다. 그러나, DDNTP는 반응 혼합물에 첨가되어 형광-표지된다. DDNTP는 데 옥시 리포스 당 분자에 3 'OH 그룹을 가지지 않기 때문에, 추가 사슬 성장은 발생하지 않을 수 있으며, 이는 사슬 성장을 종료한다. DNA의 당-포스페이트 골격은 데 옥시 리보스 당의 3 'OH 그룹과 수신 뉴클레오티드의 포스페이트 그룹 사이의 포스 포디 에스터 결합의 형성에 의해 형성된다. 그러나, DDNTP는 저농도로 첨가된다; 따라서 그들은 한 번에 체인 성장을 종료하지 않습니다.
4 가지 유형의 ddntps가 4 개의 개별 PCR 혼합물에 추가됩니다. DDATP, DDGTP, DDCTP 및 DDTTP를 추가함으로써 4 개의 개별 PCR 반응이 수행된다. 따라서, 각각의 반응 혼합물에서, 사슬 성장은 각각 a, g, c 및 t 뉴클레오티드에서 종결된다. 예를 들어, 첨가 된 DDATP와 반응 혼합물에서, 상이한 앰플 리콘의 성장은 DNA 단편의 각 뉴클레오티드에서 종결된다. Sanger 시퀀싱에 의한 DNA 서열의 결정은도 2에 도시되어있다. .
그림 2 :Sanger 시퀀싱
4 가지 유형의 뉴클레오티드 각각은 별도의 형광 색상으로 표지됩니다. ddatp에는 녹색 염료가 표시되어 있습니다. ddgtp는 노란색 염료로 표시되어 있습니다. ddctp는 파란색으로 표시되어 있습니다. ddttp에는 적색 염료 가 표시됩니다 . 따라서 4 개의 PCR 반응의 앰플 리콘은 별도의 색상으로 표시됩니다.
관심있는 DNA 단편의 증폭 후, 앰플 리콘은 겔 전기 영동 또는 모세관 전기 영동에 의해 분리된다. DNA 단편의 뉴클레오티드 서열은 방출 형광의 검출에 의해 결정될 수있다. 750-1,000베이스 쌍의 뉴클레오티드 서열은 긴 단편이 Sanger 시퀀싱에 의해 실행 당 쉽게 결정될 수있다. 그러나, 전체 게놈의 뉴클레오티드 서열의 측정은 게놈에서 다수의 뉴클레오티드로 인해 도전 가능하다. 그러나 454 시퀀싱과 같은 차세대 시퀀싱 기술은 단일 실행 당 약 2 천만 기본 쌍을 읽을 수 있습니다.
결론
DNA 시퀀싱은 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열의 결정에 사용되는 분자 생물학 기술입니다. 시퀀싱 동안, 형광-표지 된 뉴클레오티드는 PCR에 의해 DNA 단편에 첨가된다. 방출 형광을 검출함으로써, 뉴클레오티드 서열이 결정될 수있다.
참조 :
1.“DNA 시퀀싱.” <칸 아카데미 , 여기에서 사용할 수 있습니다.
이미지 제공 :
1. SJEF의“DNA 서열”-Commons Wikimedia
2를 통한 SJEF의“DNA 서열). Christoph Goemans (Modifiziert)의“Didesoxy-Methode”-Dr. Norman Mauder, AUF 기초 Einer Von Christoph Goemans (CC By-SA 3.0) wikimedia
