실험실에서 막 단백질 분리
막 단백질을 분리하려면 단백질의 특정 특성과 원하는 결과를 고려하여 다단계 과정이 필요합니다. 다음은 프로세스에 대한 일반적인 개요입니다.
1. 세포 용해 :
* 세포막을 파괴 : 이것은 세포에서 막 단백질을 방출하는 데 중요합니다. 다음을 포함한 다양한 방법이 있습니다.
* 초음파 처리 : 음파를 사용하여 세포막을 파괴합니다.
* 프랑스 언론 : 좁은 개구부를 통해 세포를 강제하기 위해 고압을 적용합니다.
* 세제 : Triton X-100 또는 Chaps와 같은 세제를 사용하여 세포막을 가용화합니다.
* 효소 : 리소자임과 같은 효소를 사용하여 박테리아 세포에서 세포벽을 분해합니다.
* 올바른 방법 선택 : 이 방법은 세포 유형, 막 단백질 특성 및 실험 목표에 의존한다. 예를 들어, 소닉 화과 같은 온화한 방법은 섬세한 단백질에 선호됩니다.
2. 세포 분획 :
* 셀 성분 분리 : 용해 후, 세포 용 해물은 소기관, 세포질 및 막 단편과 같은 다양한 성분을 함유한다. 셀 분류는 크기, 밀도 및 기타 특성에 따라 이러한 성분을 분리합니다.
* 사용 된 기술 :
* 차등 원심 분리 : 이 방법은 퇴적 속도를 기준으로 성분을 분리하기 위해 속도가 증가하는 속도로 용 해물을 회전시킵니다.
* 밀도 구배 원심 분리 : 이 방법은 부력에 따라 구성 요소를 분리하기 위해 밀도의 기울기 (예 :자당)를 사용합니다.
* 친 화성 크로마토 그래피 : 이 방법은 막 단백질과 고체 매트릭스에 부착 된 리간드 사이의 특정 상호 작용을 사용하여 단백질을 선택적으로 분리합니다.
3. 막 단백질 가용화 :
* 막 무결성 방해 : 막 단백질은 소수성이며 추가로 정제되도록 가용화되어야한다. 세제는 일반적으로 막 구조를 방해하고 단백질을 추출 할 수 있도록 사용됩니다.
* 올바른 세제 선택 : 세제는 임계 미셀 농도 (CMC), 다른 막 단백질을 용해시키는 능력 및 다운 스트림 응용과의 호환성과 같은 특성에 따라 선택됩니다.
* 다른 방법 : 경우에 따라, 지질, 인지질 또는 비 이온 세제와 같은 다른 가용성 제제를 사용하여 단백질의 천연 구조를 유지할 수 있습니다.
4. 단백질 정제 :
* 표적 단백질 분리 : 몇 가지 방법은 다음을 포함하여 정제에 사용됩니다.
* 친 화성 크로마토 그래피 : 이 방법은 표적 단백질과 고체 매트릭스에 부착 된 리간드 사이의 특정 상호 작용을 활용한다.
* 크기 제외 크로마토 그래피 : 이 방법은 크기에 따라 단백질을 분리합니다.
* 이온 교환 크로마토 그래피 : 이 방법은 전하에 따라 단백질을 분리합니다.
* 정화 최적화 : 각 방법은 최적의 분리를 달성하기 위해 완충 조성, pH 및 온도와 같은 특정 조건이 필요합니다.
5. 단백질 특성화 :
* 단백질의 정체성을 확인 : 일단 분리되면, 단백질은 동일성과 순도를 보장하기 위해 특성화되어야한다.
* 사용 된 기술 :
* SDS-PAGE : 이 기술은 단백질의 분자량에 대한 정보를 제공하여 크기에 따라 단백질을 분리합니다.
* 웨스턴 블 롯팅 : 이 기술은 항체를 사용하여 표적 단백질을 구체적으로 검출하여 동일성을 확인합니다.
* 질량 분석법 : 이 기술은 질량 대 충전 비율을 분석하여 단백질을 식별하고 정량화합니다.
중요한 고려 사항 :
* 단백질 안정성 : 막 단백질은 종종 섬세하고 분해되기 쉽다. 저온 및 적절한 완충액을 포함한 최적 조건을 유지하는 것이 전체 분리 공정에서 중요합니다.
* 단백질 활성 보존 : 분리 방법은 특히 기능적 연구를 위해 단백질의 생물학적 활동을 보존하는 것을 목표로해야합니다.
* 특정 요구 사항 : 막 단백질을 분리하기위한 특정 프로토콜은 단백질의 특성, 원하는 결과 및 이용 가능한 자원에 따라 다릅니다.
결론적으로, 막 단백질을 분리하는 것은 세심한 계획과 실행이 필요한 복잡한 과정입니다. 사용 된 특정 단계와 기술은 특정 단백질 및 실험 요구에 따라 다릅니다. 각 단계를 신중하게 고려함으로써 연구자들은 추가 연구를 위해 막 단백질을 성공적으로 분리하고 특성화 할 수 있습니다.
