아질산 나트륨 분석법에 대한 프로토콜은 표준
이 프로토콜은 아질산 나트륨을 표준으로 사용하여 질산염 환원 효소 활성을 측정하는 일반적인 방법을 설명합니다.
재료 :
* 식물 재료 : 신선한 잎, 뿌리 또는 질산염 환원 효소를 함유하는 다른 조직.
* 추출 버퍼 :
* 100 mm Tris-HCL 완충액, pH 7.5
* 1 mm EDTA
* 10 mm DTT (Dithiothreitol)
* 0.1% (w/v) 소 혈청 알부민 (BSA)
* 반응 혼합물 :
* 100 mm 칼륨 포스페이트 완충액, pH 7.5
* 질산 나트륨 10 mm
* 1 mm NADH
* 나트륨 아질산염 표준 용액 : 알려진 농도의 표준 용액 (예 :100 ppm)을 준비하십시오.
* Griess 시약 : (특정 프로토콜 지침 참조)
* 분광 광도계 : 540 nm에서 흡광도를 측정하기 위해.
* 원심 분리기 : 세포 잔해를 분리하기 위해.
* 얼음 목욕 : 추운 온도를 유지합니다.
* 피펫 및 팁 : 정확한 볼륨 측정을 위해.
절차 :
1. 샘플 준비 :
* 식물 재료를 수확하고 차가운 증류수로 빠르게 헹구십시오.
* 적절한 양의 조직 (예 :0.1-1 g)을 무게로 무게를 측정하고 모르타르에 분쇄하고 액체 질소로 유봉하거나 추출 완충액에서 균질화 제를 사용합니다.
* 세포 파편을 제거하기 위해 4 ℃에서 10 분 동안 10,000g에서 균질을 원심 분리하십시오. 상청액은 효소 추출물입니다.
2. 질산염 환원 효소 분석 :
* 효소 추출물이없는 블랭크를 포함하여 반응 혼합물을 함유하는 일련의 튜브와 다양한 농도의 나트륨 아질산염 표준을 갖는 튜브를 준비합니다.
* 반응 튜브에 적절한 부피의 효소 추출물을 첨가하십시오.
* NADH를 추가하여 반응을 시작하십시오.
* 튜브를 30 ℃에서 특정 시간 동안 (예 :30 분) 인큐베이션하십시오.
* Griess 시약을 추가하여 반응을 종료하십시오.
3. 아질산염 생산 측정 :
* 색상 개발을 위해 최소 15 분 동안 어둠 속에서 튜브를 배양하십시오.
* 분광 광도계를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하십시오.
* 알려진 농도의 아질산 나트륨을 사용하여 표준 곡선을 준비하십시오.
* 표준 곡선을 사용하여 효소 추출물에 의해 생성 된 아질산염의 양을 계산하십시오.
4. 질산염 환원 효소 활성의 계산 :
* 질산염 환원 효소 활성을 발현 신선한 중량 (FW) 또는 단백질 당 분당 분당 생산 된 아질산염의 μmoles로서. .
참고 :
*이 프로토콜은 기본 개요이며 식물 종과 실험 설정에 따라 특정 수정이 필요할 수 있습니다.
* 모든 솔루션이 신선하게 준비되고 적절하게 저장되어 있는지 확인하십시오.
* 정확한 결과를 위해 고품질 시약을 사용하십시오.
* 효소 추출물이없는 블랭크의 흡광도를 측정하여 배경 흡광도에 대한 제어.
* 재현성을 보장하기 위해 분석을 3 번 이상 반복하십시오.
griess 시약 :
* Griess 시약은 자주색의 아조 염료를 생성하기 위해 아질산염을 감지하는 데 사용됩니다.
* 다른 Griess 시약을 사용할 수 있으므로 준비 및 사용을 위해 특정 프로토콜을 참조하십시오.
대체 방법 :
* 질산염 환원 효소 활성을 측정하기위한 다른 방법은 질산염을 기질로 사용하는 것입니다 질산염의 아질산염 감소를 감지합니다.
* 분광 광도 측정 시간이 지남에 따라 NADH 농도의 변화를 직접 측정하기 위해 사용될 수 있습니다.
해석 :
질산염 환원 효소 활성은 질산염을 아질산염으로 줄이는 식물의 능력을 나타내는 지표이며, 이는 질소 동화의 중요한 단계입니다. 다른 조직 또는 다른 조건에서 활동을 비교하면 식물의 질소 대사에 대한 귀중한 정보가 나타날 수 있습니다.
추가 정보 :
* 특정 식물 종 또는 조건에 대한 프로토콜 수정 : 지침은 관련 과학 문헌을 참조하거나 전문가에게 문의하십시오.
* 문제 해결 : 분석에 문제가 발생하면 문제 해결 가이드 또는 상담 전문가에게 상담하십시오.
이 프로토콜은 아질산 나트륨을 표준으로 사용하여 질산염 환원 효소 활성을 측정하기위한 일반적인 프레임 워크를 제공합니다. 특정 요구에 맞게 조정하고 정확한 결과를 확인하십시오.
