1. 인간 관심 유전자를 얻는다
* 인간 DNA로부터의 분리 : 원하는 인간 유전자는 제한 효소 소화 또는 PCR과 같은 기술을 사용하여 인간 세포로부터 추출된다 (중합 효소 연쇄 반응).
* 합성 : 유전자는 또한 유전자 합성 기술을 사용하여 인위적으로 합성 될 수 있으며, 이는 종종 복잡한 유전자에 더 효율적이다.
2. 플라스미드 벡터 준비
* 플라스미드 선택 : 적합한 플라스미드 벡터가 선택되며, 종종 다중 클로닝 부위 (MCS), 항생제 내성 유전자 및 복제를 용이하게하는 다른 특징을 갖는 것이 선택됩니다.
* 제한 효소 소화 : 플라스미드는 제한 효소를 사용하여 특정 부위에서 열려서 인간 유전자와 호환되는 "끈적 끈적한 끝"을 만듭니다.
3. 유전자 및 플라스미드의 결찰 (결합)
* 호환성 : 인간 유전자의 끈적 끈적한 끝과 선형화 된 플라스미드는 호환되도록 설계되어 보완적인 염기 쌍을 통해 함께 결합 할 수 있습니다.
* 리가 제 효소 : DNA 리가 제는 인간 유전자를 플라스미드로 영구적으로 결합하는 포스 포 디에스 테스터 결합의 형성을 촉매하는데 사용된다.
4. 박테리아로의 전환
* 유능한 세포 : 박테리아 세포는 열 충격 또는 전기 천공과 같은 다양한 방법으로 DNA를 섭취하도록 "유능한"것으로 만들어졌습니다.
* 소개 : 재조합 플라스미드는 유능한 박테리아에 도입된다.
* 선택 : 플라스미드를 성공적으로 취한 박테리아는 항생제가 함유 된 배지에서 자라서 선택됩니다. 항생제 내성 유전자로 인해 플라스미드가있는 박테리아만이 자랄 것입니다.
5. 확인 및 확인
* 식민지 PCR : PCR은 박테리아 식민지 내에서 인간 유전자의 존재를 확인하는 데 사용됩니다.
* 시퀀싱 : 삽입 된 유전자 서열은 DNA 시퀀싱에 의해 검증되어 정확하고 손상되지 않도록합니다.
주요 구성 요소 및 고려 사항 :
* 제한 효소 : 이 효소는 특정 서열에서 DNA를 자르고 결찰을위한 호환되는 끝을 만듭니다.
* DNA 리가 제 : 이 효소는 DNA 가닥의 끝을 함께 연결합니다.
* 항생제 내성 마커 : 플라스미드의 이들 유전자는 플라스미드를 성공적으로 포함시킨 박테리아의 선택을 허용한다.
* MCS (다중 클로닝 사이트) : 플라스미드 의이 영역은 다수의 제한 효소 부위를 함유하여 상이한 유전자의 삽입을 허용한다.
왜 이것이 중요한가?
* 단백질 생산 : 재조합 박테리아는 치료 목적으로 인슐린 또는 성장 호르몬과 같은 대량의 인간 단백질을 생산하는 데 사용될 수 있습니다.
* 연구 도구 : 재조합 플라스미드는 유전자 클로닝 및 유전자 발현 연구에 필수적이다.
* 유전자 요법 : 어떤 경우에는, 치료 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드가 유전자 요법에서 세포에 시정 유전자를 전달하는데 사용될 수있다.
참고 : 과정의 구체적인 세부 사항은 복제되는 유전자, 박테리아 숙주 및 원하는 적용에 따라 달라질 수 있습니다.
