1. 형질 전환 된 세포에 대한 선택
* 항생제 내성 : 가장 흔한 방법은 플라스미드 내에 항생제 내성 유전자를 포함시키는 데 의존한다. 이 유전자는 형질 전환 된 박테리아가 특정 항생제를 포함하는 성장 배지에서 생존 할 수있게한다. 변형되지 않은 박테리아는 자라지 않을 것입니다.
* 기타 선택 가능한 마커 : 일부 플라스미드는 다음과 같은 대안적인 선택 이점을 제공하는 유전자를 가지고 있습니다.
* 색상 변화 : 컬러 제품 (블루/흰색 선별 검사) 또는 변화하는 식민지 색상 생산.
* 특정 미디어의 성장 : 박테리아가 일반적으로 요구하는 특정 영양소가없는 배지의 성장을 가능하게합니다.
2. 플라스미드 통합의 검증
* pcr : 중합 효소 연쇄 반응을 사용하여 플라스미드로부터 특정 유전자 서열을 증폭시킬 수있다. 이것은 형질 전환 된 박테리아 내에서 플라스미드 DNA의 존재를 확인한다.
* 제한 효소 소화 : 특정 효소는 독특한 서열에서 DNA를 절단한다. 소화 후 DNA 단편의 크기를 분석하면 플라스미드의 존재 및 그 완전성을 확인할 수 있습니다.
* DNA 시퀀싱 : 이 기술은 변형 된 박테리아 내에서 정확한 DNA 서열을 직접 결정합니다. 그것은 삽입 된 유전자의 존재를 확인하고 원치 않는 돌연변이를 배제합니다.
3. 기능 분석 (유전자에 따라)
* 단백질의 발현 : 플라스미드가 단백질을 암호화하는 유전자를 가지고있는 경우, 웨스턴 블 롯팅 또는 효소 분석과 같은 기술을 사용하여 그 단백질의 존재를 테스트 할 수 있습니다.
* 표현형 변화 : 플라스미드에 삽입 된 유전자가 박테리아 표현형에 영향을 미치는 경우 (예를 들어, 특정 효소를 생성하거나 신진 대사를 변화시키는 능력) 변형 된 박테리아에서 이러한 변화를 관찰 할 수 있습니다.
예 :일반적인 변형 실험
1. 플라스미드 : 당신은 암피실린 저항성 유전자 (AMPR)를 함유하는 플라스미드와 형광 단백질 (GFP)을위한 유전자를 사용합니다.
2. 변형 : 플라스미드를 박테리아에 소개합니다.
3. 선택 : 암피실린을 함유 한 한천 플레이트에서 박테리아를 자랍니다. 암피실린 저항성 유전자가있는 박테리아만이 자랄 것입니다.
4. 검증 : PCR을 사용하여 GFP 유전자의 존재를 확인한 다음 형광을 위해 현미경으로 식민지를 관찰 할 수 있습니다.
중요한 고려 사항 :
* 대조군 : 항상 음성 대조군 (변환되지 않은 박테리아)과 양성 대조군 (특정 플라스미드로 변형 된 것으로 알려진 박테리아)을 포함하여 결과를 검증합니다.
* 효율성 : 형질 전환 효율은 플라스미드를 성공적으로 취하는 박테리아의 백분율입니다. 이것은 박테리아 균주, 플라스미드 및 형질 전환 방법에 따라 달라질 수 있습니다.
* 다중 기술 : 종종 선택, 검증 및 기능 분석 기술의 조합은 성공적인 변환의 가장 강력한 확인을 제공합니다.
특정 변환 프로토콜 또는 실험에 대해 더 많은 질문이 있으면 알려주세요!
