핵심 개념
이 기사에서는 분자 클로닝이라는 DNA 증폭의 기본 기술에 대해 배우게됩니다. 절차 뒤의 생화학과 몇 가지 중요한 응용 분야를 살펴 보겠습니다.
공부 DNA
생물학 및 생화학의 다양한 분야에서 DNA 분석은 생물학적 시스템을 이해하는 데 중요한 역할을합니다. 그러나, DNA 서열은 실제로 젤을 가동하거나 광 흡수를 측정하는 방법을 사용하여 고농도로만 분석 할 수 있습니다. 이것은 특정 유전자 또는 서열에 관심이있는 과학자들에게 어려움을 나타냅니다. 결국, 인간 유전자는 보통 세포 내부에 소수의 사본을 가지고 있습니다. 이러한 저농도는 관심있는 과학자에게 서열 정보가 거의 없습니다.
따라서, DNA가 과학자들에게 관심있는 분자가 되었기 때문에, 대량의 DNA 서열을 복제하고 생산하는 기술은 중요하지 않았다. 실제로, DNA 증폭 과정은 유전자 변형, 산업용 약물 생산, 병원체 검사, 유전자 스크리닝 및 DNA 지문과 같은 다양한 중요한 응용을 가지고 있습니다.
이러한 각 응용 프로그램이 어떻게 수행되는지 이해하려면 가장 중요한 증폭 기술 중 하나 인 분자 클로닝을 살펴 보겠습니다. 또 다른 중요한 기술에 대해 배우려면 PCR에 대한 기사를 확인하십시오.
분자 클로닝
분자 클로닝은 박테리아가 자연적으로 수행되도록 DNA 복제를 활용합니다. 구체적으로, 원하는 서열을 살아있는 박테리아 세포에 배치하고 여러 번 복제 할 수있게한다. 이로 인해 각각이 원하는 DNA 서열이있는 수백만 개의 박테리아가 생길 수 있습니다.
살아있는 박테리아 균주 외에도 (보통 e. coli ), 분자 클로닝을 효과적으로 사용하려면 두 가지 중요한 구성 요소가 필요합니다.
- 클로닝 벡터
- 제한 엔도 뉴 클레아 제
클로닝 벡터는 원하는 서열을 재현 할 수있는 짧은 DNA입니다. 본질적으로, 박테리아는 형질 도입이라는 과정을 통해 플라스미드라고 불리는 작은 DNA 조각을 흡수한다. 여기에는 박테리아 막 및 세포벽을 가로 질러 DNA가 수송하는 것이 포함됩니다. 일단 안으로 들어가면, 박테리아는 플라스미드에서 유전자를 발현 할 수있을뿐만 아니라 플라스미드를 딸 세포로 복제하고 전달할 수있다. 종종 복제 벡터에는 서열을 성공적으로 변환 한 박테리아를 선택하는 데 유용한 항생제 내성 유전자가 포함되어 있습니다.
제한 엔도 뉴 클레아 제는 특정 서열에서 DNA를 절단하는 효소이다. 제한 효소가 결합하고 절단되는 특정 서열을 "인식 사이트"라고합니다. 흥미롭게도, 이들 효소는 2 개의 DNA 가닥을 다른 지점에서 절단하여 짧은 짝을 이루지 않은 뉴클레오티드를 생성한다. 생화학 자들은이 짝을 이루지 않은 스트레치를 "끈적 끈적한 끝"이라고 부릅니다. 
이러한 성분이 DNA 증폭을 허용하는 방법을 이해하려면 분자 클로닝 단계를 자세히 살펴 봐야합니다.
첫 단계 :DNA 서열 삽입
분자 클로닝을 사용하여 DNA를 효과적으로 증폭시키기 위해, 첫 번째 단계는 원하는 서열을 클로닝 벡터에 삽입하는 것입니다. 이렇게하려면 선택한 엔도 뉴 클레아 제에 대한 인식 사이트가 포함 된 클로닝 벡터를 선택해야합니다. 또한 귀하의 관심 시퀀스를 포함하는 매우 짧은 DNA 이중 가닥과 시퀀스의 상류 및 다운 스트림을 포함하는 매우 짧은 DNA 이중 가닥을 엔지니어링해야합니다. 따라서, 당신의 제한 효소가 클로닝 벡터와 관심 서열을 절단 할 때, 끈적 끈적한 끝은베이스 페어를 할 수있다. 그런 다음, DNA 리가 제가 벡터의 가닥과 서열을 함께 연결하는 반응을 촉매 할 수 있습니다.
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두 번째 단계 :플라스미드를 박테리아로 가져 오는
둘째, 방금 만든 벡터 시퀀스 플라스미드를 흡수하려면 박테리아 세포가 필요합니다. 형질 도입은 일반적으로 효율이 낮습니다. 박테리아는 외래 플라스미드를 자발적으로 거의 흡수하지 않습니다. 플라스미드를 늘리는 박테리아의 확률을 높이려면 "열 충격"을 수행 할 수 있습니다. 여기에는 박테리아 문화를 오랫동안 차갑게 유지 한 다음 온도를 빠르게 높이는 것이 포함됩니다. 실제로, 효과적인 열 충격은 박테리아 튜브를 얼음 위에 잠시 동안 유지 한 후 따뜻한 물에 빠른 덩크가 될 것입니다. 열 충격은 박테리아 세포벽의 투과성을 증가시켜 형질 도입 효율을 증가시킵니다. 그럼에도 불구하고 열 충격을 받더라도 배양에서 박테리아가 상대적으로 적습니다.
세 번째 단계 :원하는 박테리아 분리
셋째, 플라스미드가있는 박테리아와 그렇지 않은 박테리아를 분리해야합니다. 이것은 클로닝 벡터의 항생제 내성 유전자가 작동하는 곳입니다. 전형적으로, 액체 박테리아 배양은 항생제 및 영양소를 함유 한 판에 퍼져있다. 이것은 플라스미드가있는 박테리아가 생존하고 자라는 반면, 플라스미드가없는 것은 생존하지 않습니다.
네 번째 단계 :DNA 서열 수확
넷째, 내성 박테리아를 자라서 플라스미드를 수확해야합니다. 한 가지 방법은 피펫 팁을 사용하여 항생제 판에 박테리아 식민지를 찌르고 플라스미드가 있어야하고 팁을 영양 국물에 넣는 것입니다. 이것은 플라스미드로 박테리아의 집단을 엄청나게 증가시켜 투명한 국물이 흐려집니다. 그런 다음 알칼리성 조건 하에서 박테리아를 없애고 원심 분리 및 컬럼 크로마토 그래피를 통해 플라스미드를 정화 할 수 있습니다. 이것은 박테리아와는 별도로 원하는 조각을 집중시킵니다.
분자 클로닝의 적용
식물의 유전자 변형
분자 클로닝의 가장 영향력있는 응용 중 하나는 농업에서 유전자 변형 유기체의 발달에 관한 것입니다. 생명 공학의 발전으로 농업 산업은 품질을 향상시키고 수율을 높이기 위해 유전자 변형 작물에 큰 투자를 해왔습니다. 이 유전자 변형 작물은 종종 잡초를 죽이는 해충과 제초제에 유전자 저항성을 가지고 있습니다.
식물을 유전자로 변형시키기 위해 농업 과학자들은 박테리아 종 Agrobacterium tumafaciens, 를 사용합니다. 알려진 식물 병원체. 본질적으로, a. tumafaciens 플라스미드를 플라스미드의 T-DNA 영역으로 인한 종양의 형성을 유도하는 식물 조직에 플라스미드를 임플란트시킨다. 분자 클로닝을 사용하여 과학자들은 T-DNA 영역이 다른 유전자로 대체되는이 플라스미드의 버전을 구성하고 증폭시킬 수 있습니다. 이것은 농업 산업에 유리한 유전자를 공장 조직으로의 방법으로 제공합니다.
단백질 생산
분자 클로닝의 또 다른 중요한 적용은 제약 약물에 사용되는 단백질의 질량 생산을 포함한다. 이러한 경우, 클로닝 벡터에 이식 된 서열은 일부 치료 값을 갖는 단백질에 대한 유전자를 포함한다. 박테리아로 형질 도입 될 때 박테리아의 분자 기계는 유전자를 전사하고 번역하여 관심있는 단백질을 합성합니다. 여러 세대에 걸쳐 복제되면 대량의 단백질을 생산할 수 있습니다.
당뇨병 환자에게 중요한 약물 인 인슐린은 과학자들이 분자 클로닝을 사용하여 만들 수있는 단백질 중 하나입니다.
