핵심 개념
이 기사에서 우리는 병력, 상세 메커니즘 및 실제 사용을 포함하여 PCR로 더 잘 알려진 중합 효소 연쇄 반응에 대해 모두 배웁니다.
공부 DNA
생물 학자들이 DNA의 중요성을 깨닫기 시작한 이래로, DNA 서열을 분리하고 복제하는 기술은 생물학적 연구에서 중요했다. 구체적으로, 과학자들은 광 흡수, 겔 전기 영동 및 기타 방법을 통해 분석 할 수있는 높은 농도의 특정 DNA를 생성하는 데 필요한 이러한 기술.
수십 년 동안, DNA의 스트레치를 증폭시키는 주요 방법은 공정 생화학자가 분자 클로닝을 포함했습니다. 그러나,이 방법은 종종 농축 된 DNA 샘플을 생성하기 위해 몇 주가 아니라 일이 필요했습니다. 따라서 과학자들 사이의 수요는 새로운 기술의 발전을 위해 높았습니다. 이것은 PCR 또는 중합 효소 연쇄 반응이 시작되는 곳입니다.
한때 느리고 비용이 많이 드는 프로세스는 효율적이고 단순하며 신뢰할 수있게되었습니다. PCR을 통해 과학자들은 DNA 지문, 친자 관계 검사 및 바이러스 감염 검사와 같은 DNA와 관련된 많은 새로운 응용 분야를 개발했습니다.
오늘날의 중요성으로 인해, PCR은 정확히 무엇입니까? PCR이 과학을 어떻게 혁명화했는지 이해하려면 더 가까이 다가 가야합니다.
PCR이란 무엇입니까?
분자 클로닝과 마찬가지로 PCR에는 두 가지 중요한 구성 요소가 필요합니다.
- DNA 프라이머
- Taq DNA 폴리머 라제
그러나 분자 클로닝과 달리 PCR은 박테리아 균주 나 살아있는 유기체가 필요하지 않습니다. 대신, DNA는 순전히 화학적 수단에 의해 증폭된다.
중요한 것은 복제하려는 순서에 대한 정보를 알아야합니다. 원하는 시퀀스 직전과 직후에 작은 기지를 알아야합니다. PCR이 작동하려면 이러한 스트레치에 해당하는 단일 가닥 DNA (SSDNA)의 짧은 시퀀스를 설계해야합니다. 생화학 자들은이 스트레치를 "프라이머"라고 부르며 하나는 두 가지가 필요합니다. 하나는 원하는 시퀀스 전에 DNA와 쌍을 이루고 원하는 시퀀스 후에 보완 된 DNA와 쌍을 이루는 하나는 하나입니다. 따라서, 두 번째 프라이머는 다른 가닥에서 원하는 서열 후 DNA에 결합합니다.
DNA 프라이머와 함께 Taq DNA 폴리머 라제라는 특수 효소가 필요합니다. 모든 유기체는 일부 형태의 DNA 폴리머 라제를 가지고 있으며, 이는 프라이머를 사용하여 DNA 가닥을 조립합니다. 그러나, TAQ DNA 폴리머 라제는 독특한 기원을 갖는다 :옐로 스톤의 화산 영역에 사는 미생물 종. 따라서, 이러한 형태의 DNA 폴리머 라제는 고온에서 기능하도록 고유하게 적응하여보다 빠른 중합을 가능하게한다. 또한, 대부분의 DNA 폴리머 라제와 달리 TAQ 품종은 고온에서 변성하지 않습니다.
일단 당신은 유리 뉴클레오티드 트리 포스페이트의 용액에서 원하는 서열과 함께 DNA 프라이머와 TAQ DNA 폴리머 라제를 모두 갖게되면, PCR이 발생할 수있다. 반응 혼합물은 3 개의 별개의 온도 단계를 통과해야하며,이 사이클은 여러 번 반복되어 시퀀스를 완전히 증폭시킵니다.
PCR 1 단계 :변성
첫 번째 단계에서, 반응 혼합물의 온도는 원하는 시퀀스가 "denature"또는 "melt"로 DNA에 대해 충분히 높아집니다. 이것은 단순히 두 가닥이 분리되어 있음을 의미합니다. 이 단계에서 원하는 서열은 훨씬 더 큰 가닥의 DNA에 내장되어 있습니다. 이것은 전체 염색체만큼 클 수 있지만 박테리아 플라스미드가되는 것이 훨씬 더 일반적입니다.
PCR 2 단계 :어닐링
두 번째 단계에서는 반응 혼합물의 온도가“어닐링”이 발생합니다. 여기에는 DNA 프라이머의 각각의 서열에 결합이 포함됩니다. 프라이머는 가닥보다 훨씬 짧기 때문에, 더 긴 가닥은 프라이머보다 훨씬 빠르게 결합합니다.
PCR Phase 3 :확장
세 번째 단계에서, 온도는 천천히 증가하여 Taq DNA 폴리머 라제가 프라이머에 결합 할 수있게한다. 이어서, 효소는 보완 된 DNA 가닥으로 염기를 쌍으로하여 프레드의 길이를 따라 프라이머를 연장하는 뉴클레오티드 트리 포스페이트를 자유롭게 떠 다니는 것을 모집한다. 모든 DNA 폴리머 라제는 5 '내지 3'방향으로 만 DNA 복제를 수행 할 수 있으므로, 복제 된 DNA는 항상 원하는 서열 자체 또는 그 보체를 포함한다. 부모 DNA의 이중 가닥 별,이 단계는 프라이머에서 시작하는 약간 더 짧은 DNA의 두 개의 단일 가닥을 형성합니다.
PCR Phase 4 :반복
이 동일한 3 개의 온도상은 원하는 시퀀스를 증폭시키기 위해 수십 ~ 수백 번 반복합니다. 두 번째 사이클이 시작되면, 이전 사이클에서 형성된 약간 더 짧은 DNA는이를 생성하는 반대 프라이머에 결합 할 것이다. 일단 중합 효소에 의해 복제되면, 결과 스트랜드는 원하는 서열 (또는 그 보체) 및 프라이머에 해당하는 짧은 서열을 포함한다.
이후 사이클에서,이 짧은 서열에 대한 모든 후속 프라이머 결합은 동일한 서열 또는 그 보체로 동일한 길이의 추가 스트레칭을 산출한다. 물론, 원래의 부모 DNA에서도 추가 복제가 발생하지만, 여러주기에 걸쳐 원하는 서열이있는 DNA의 양은 다른 DNA의 난쟁이를 난쟁합니다. 이를 통해 원하는 시퀀스를 성공적으로 증폭시키고 농축 용액을 생성했습니다.
PCR의 응용
일상 생활에서 PCR의 실제 유용성은 특정 DNA 서열의 존재를 식별하는 능력에서 비롯됩니다. 주어진 샘플에 특정 서열의 DNA가 있는지 테스트하려면 원하는 서열의 섹션에 해당하는 프라이머를 설계 할 수 있습니다. 그런 다음 해당 샘플에서 PCR을 수행 할 때 발생하는 유일한 DNA 복제에는 원하는 시퀀스가 포함되어야합니다. TAQ DNA 폴리머 라제는 프라이머에서 템플릿 가닥까지 DNA 가닥을 합성 할 수 있기 때문입니다.
이것은 추상적으로 보일지 모르지만 일부 바이러스 성 병원체의 DNA 서열을 알고 있다고 상상해보십시오. 해당 DNA와 함께 선택적으로베이스 쌍으로 프라이머를 디자인 할 수 있습니다. 또는 가능한 용의자와 범죄 현장의 혈액 샘플이 있다고 상상해보십시오. 용의자의 DNA에서 고유 한 시퀀스 (짧은 탠덤 반복)에 선택적으로 결합하는 프라이머를 설계 할 수 있습니다. 또는 친자 관계 테스트의 맥락에서 부모를 결정하기 위해 유사한 절차를 수행 할 수 있습니다.
겔 전기 영동
그러나 관심있는 DNA에서 복제가 발생했는지 어떻게 알 수 있습니까? 완성 된 PCR 반응을 분석하기 위해 샘플을 아가 로스 겔에로드하고 겔 전기 영동을 수행합니다. 이 절차에는 양쪽 끝에 2 개의 큰 전극이있는 완충 용액에 겔을 배치하는 것이 포함됩니다. 상단에서 샘플이있는 우물 근처에는 음으로 하전 된 전극 (또는 양극)이 있으며, 반대쪽에는 양으로 하전 된 전극 (또는 음극)이 존재합니다.
샘플을로드하고 전극을 켜면 DNA가 음극을 향해 이동하기 시작합니다. 이는 DNA가 포스페이트 골격으로 인해 대부분의 pH 수준에서 음전하가 있기 때문입니다. 중요하게도, 작은 DNA 조각은 큰 조각보다 겔을 통해 더 빠르게 움직입니다. 단 몇 분 (20 분 미만) 후에, 작은 조각은 우물을 크게 이동하는 반면, 부모 가닥은 기본적으로 같은 장소에 남아 있습니다. UV 빛 아래에서 이미지화되면 원하는 DNA의 작은 조각의 밴딩을 시각적으로 볼 수 있습니다.
