Illumina 시퀀싱은 차세대 시퀀싱 방법이며,“ 시퀀싱 별 일시적 라고도합니다. " 방법. 일루미나 시퀀싱은 수백만 개의 조각을 병렬로 처리하는 데 관여합니다. Illumina 시퀀싱 워크 플로와 관련된 4 가지 기본 단계는 라이브러리 준비, 클러스터 생성, 시퀀싱 및 데이터 분석입니다.
주요 영역이 적용됩니다
1. Illumina 시퀀싱
- 정의, 사실, 장점
2. 일루미나 시퀀싱은 어떻게 작동합니까
- Illumina 시퀀싱 프로세스 :
- 라이브러리 준비
- 클러스터 생성
- 시퀀싱
- 데이터 분석
주요 용어 :클러스터 생성, 데이터 분석, 일루미나 시퀀싱, 라이브러리 준비, 합성에 의한 시퀀싱
Illumina 시퀀싱이란 무엇인가
일루미나 시퀀싱 또는 시퀀싱 별 시퀀싱 (SBS) 기술은 세계에서 가장 널리 사용되는 차세대 시퀀싱 기술입니다. 세계 시퀀싱 데이터의 90% 이상이 Illumina 시퀀싱에 의해 생성됩니다. 그것은 원래 케임브리지 대학교의 Shankar Balasubramanian과 David Klenerman에 의해 개발되었습니다. 그들은 1998 년에 Solexa로 알려진 회사를 설립했습니다. 그런 다음 Illumina는 2007 년에 Solexa를 구매하여 독창적 인 기술을 빠르게 향상 시켰습니다. 따라서이 방법은 solexa/illumina 시퀀싱 방법 라고도합니다 . Illumina 시퀀싱의 주요 장점은 높은 수율의 오류가없는 읽기를 제공한다는 것입니다.
Illumina 시퀀싱은 어떻게 작동합니까
Illumina 시퀀싱과 관련된 4 단계는 다음과 같습니다.
1 단계. 라이브러리 준비
- 시퀀싱 라이브러리는 동시에 태도 에 의해 준비됩니다. DNA의 짧은 세그먼트에 대한 200-600베이스 쌍의 짧은 세그먼트로 트랜스 포 타제에 의해 태도로 알려진 공정에서, 그 후 DNA의 짧은 세그먼트의 3 '및 5'말단으로의 어댑터 결찰
- 시퀀싱 프라이머 바인딩 부위, 인덱스 및 영역과 같은 추가 주제는 감소 된 사이클 증폭 에 의해 양쪽의 어댑터에 추가됩니다. . 모티프의 태도 및 첨가는 그림 1 에 나와 있습니다. .
그림 1 :모티프의 태도 및 추가
2 단계. 클러스터 생성
- 준비된 시퀀싱 라이브러리는 변성되어 흐름 셀 에로드됩니다. 클러스터 생성을 위해. 클러스터 생성 동안, 시퀀싱 라이브러리의 각 단편은 등온 적으로 증폭된다. 유동 셀은 유리를 함유 한 유리로 구성됩니다. 각 차선은 두 가지 유형의 올리고 뉴클레오티드로 코팅됩니다. 한 유형은 추가 모티프의 5 '영역에 상보 적이며 다른 유형은 준비된 라이브러리의 추가 모티프의 3'영역에 상보 적이다. 따라서, 이들 oligos는 시퀀싱 라이브러리에서 DNA의 상응하는 영역에 결합한다. 두 가지 유형의 oligos가있는 유량 셀은 그림 2 에 표시됩니다. . 시퀀싱 라이브러리의 5 '영역에 결합하는 올리고는 핑크색이며 시퀀싱 라이브러리의 3'영역에 결합하는 올리고는 녹색입니다.
그림 2 :유량 셀
- 단일 가닥 시퀀싱 라이브러리가 올리고에 바인딩되면 상보 적 가닥은 DNA 폴리머 라제에 의해 생성됩니다. 그런 다음 결과 이중 가닥 DNA가 변성되고 원래 가닥이 씻겨집니다.
- 클론 증폭 조각의는 브리지 앰프 를 통해 달성됩니다 . 이 과정에서, 가닥은 흐름 셀의 두 번째 유형의 올리고를 접 힙니다. 그런 다음 중합 효소는 이중 가닥 브리지를 합성합니다. 브리지의 변성은 두 개의 DNA 가닥을 초래합니다 :유량 셀의 올리고스에서 전방 및 역방향 가닥이 있습니다.
- 교량 증폭은 반복적으로 반복되어 클론 증폭에 의해 시퀀싱 라이브러리에서 모든 유형의 단편의 수백만 개의 클러스터를 동시에 얻습니다. 클론 증폭은 도 3에 도시되어있다 .
그림 3 :클론 증폭
- 그러면 역 가닥이 씻겨지면서 흐름 셀의 순방향 가닥 만 유지합니다. 전방 가닥에서, 3 '말단은 자유롭고 원치 않는 프라이밍을 방지하기 위해 차단됩니다.
단계 3. 시퀀싱
먼저 역 순서를 읽었습니다
-
시퀀싱은 첫 번째 시퀀싱 프라이머의 확장으로 시작됩니다 . 일루미나 시퀀싱 방법은 데 옥시 리보스 설탕의 3 '위치에서 터미네이터를 함유하는 변형 된 DNTP를 사용한다. 이 DNTP는 또한 다른 색상으로 형광으로 표지됩니다.
-
각각의 상보적인 뉴클레오티드를 첨가 한 후, 유동 셀의 클러스터는 형광 방출을 위해 관찰된다.
. -
빛을 검출 한 후, 형광 단이 세척 할 수 있습니다.
-
그런 다음 설탕의 3 '위치의 터미네이터 그룹은 하이드 록실 그룹에 의해 재생되어 성장 사슬에 두 번째 DNTP를 첨가 할 수 있습니다. 이 과정을 시퀀싱 별 일시적으로 알려져 있습니다. 시퀀싱 별 합성은 도 4에 도시되어있다
그림 4 :시퀀싱 별 합성
- 합성이 완료되면 먼저 리버스 시퀀스 획득되고 시퀀싱 생성물을 세척합니다.
인덱스 1 읽기
- 인덱스 1 프라이머는 클러스터로 혼성화되어 동시별 시퀀싱에 의해 동일한 방식으로 두 번째 읽기를 생성합니다. 시퀀싱 생성물을 세척합니다.
인덱스 2 읽기
- 클러스터의 3 '말단은 탈포하여 플로우 셀에서 두 번째 유형의 올리고로 3'말단의 혼성화를 허용합니다 (녹색). 이에 의해, 인덱스 2 영역의 서열이 얻어진다. 시퀀싱 생성물을 세척합니다.
전방 시퀀스의 두 번째 읽기
- 두 번째 유형의 oligo는 폴리머 라제에 의해 확장되어 이중 가닥 다리를 형성합니다. 다리는 변성되고 그들의 3 '끝이 차단된다. 전방 가닥이 씻겨진다.
- 전방 시퀀스의 두 번째 읽기 두 번째 시퀀싱 프라이머의 혼성화 및 확장에 의해 시퀀싱 별 합성을 통해 얻어진다.
4 단계. 데이터 분석
- 시퀀싱에 의해 얻은 수십억 개의 독서는 인덱스 시퀀스를 기반으로 그룹화됩니다.
- 그런 다음 비슷한 판독 값이있는 시퀀스가 클러스터됩니다.
- 앞으로 및 리버스 리드는 연속 시퀀스를 형성하기 위해 쌍을 이룹니다.
- 모호한 정렬은 쌍을 이루는 시퀀스로 해결할 수 있습니다.
- 연속 시퀀스는 변형 식별을 위해 기준 게놈에 정렬됩니다.
다음 비디오는 Illumina 시퀀싱의 전체 과정을 설명합니다.
결론
Illumina 시퀀싱은 차세대 시퀀싱 방법입니다. 일루미나 시퀀싱은 200-600베이스 쌍의 긴 DNA 조각을 갖는 시퀀싱 라이브러리의 제조에 관여한다. 일루미나 시퀀싱에 관여하는 4 단계는 라이브러리 준비, 클러스터 생성, 시퀀싱 및 데이터 분석입니다. Illumina 시퀀싱은 시퀀스 읽기를 높은 정확도로 제공하기 때문에 세계에서 널리 사용되는 시퀀싱 방법입니다.
참조 :
1.“합성 (SBS) 기술에 의한 시퀀싱.” 시퀀싱 기술 | 합성에 의한 시퀀싱 , 여기에서 사용할 수 있습니다.
이미지 제공 :
1. DMlapato의“DNA 처리 준비”-Commons Wikimedia
2를 통한 자신의 작업 (CC By-SA 4.0). Dmlapato의 "유량 세포의 올리고 뉴클레오티드 체인"-자체 작업, (CC By-SA 4.0)는 Commons Wikimedia
3을 통한 (CC BY-SA 4.0) (CC BY-SA 4.0) "ABIZAR LAKDAWA의 합성 역할을 수행 할 수있는 역전제"- Commons Wikimedia
4를 통해 나 자신 (CC By-SA 3.0)에 의해 전적으로이 작품을 만들었습니다. Dmlapato의 "클러스터 생성"-Commons Wikimedia
