1. 단백질 추출 및 제조 :
- 첫 번째 단계는 관심있는 샘플에서 단백질을 추출하는 것입니다. 이것은 세포 용해 또는 조직 균질화와 같은 다양한 방법을 사용하고, 세포 파편을 제거하기 위해 원심 분리를 사용하여 수행 할 수 있습니다.
- 추출 된 단백질은 후속 단계에서 동일한 단백질 로딩을 보장하기 위해 일반적으로 브래드 포드 분석 또는 유사한 방법을 사용하여 정량화된다.
2. 단백질 분리 :
- 단백질 샘플은 환원제 (예를 들어, 베타- 메르 캡토 에탄올 또는 DTT) 및 추적 염료 (예 :브로 모 페놀 블루)를 함유하는 로딩 완충제와 혼합된다.
- 단백질 혼합물은 전기 영동을 위해 폴리 아크릴 아미드 겔에 로딩된다. 겔은 전류에 노출되어 단백질이 크기에 따라 분리되게한다. 작은 단백질은 겔을 통해 더 빠르게 이동하는 반면, 더 큰 단백질은 더 느리게 움직입니다.
3. 단백질 전달 :
- 전기 영동 후, 분리 된 단백질은 겔로부터 니트로 셀룰로스 막 또는 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 (PVDF) 막으로 옮겨진다. 단백질 블 롯팅 또는 전기 블 롯팅으로 알려진이 과정은 겔과 막을 전달 완충제에 넣고 전류를 적용하는 것을 포함한다.
- 결과적으로, 단백질은 겔에서 막으로 옮겨져 분리 된 단백질의 복제본을 생성한다.
4. 멤브레인 차단 :
-항체의 비특이적 결합을 감소시키기 위해, 니트로 셀룰로스 또는 PVDF 막은 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 비 지방 건조 우유와 같은 단백질을 함유하는 용액으로 차단된다.
-이 차단 단계는 후속 단계에서 배경 신호를 최소화하고 항체 결합의 특이성을 향상시키는 데 도움이됩니다.
5. 1 차 항체 배양 :
- 막에는 관심있는 단백질을 특이 적으로 인식하고 결합하는 1 차 항체와 함께 배양된다. 1 차 항체는 전형적으로 표적 단백질 또는 단백질 내 특이 적 에피토프에 대해 생성된다.
- 이들 항체는 적절한 완충액으로 희석되고 막과 함께 배양하여 표적 단백질에 결합 할 수있다.
6. 세척 :
- 1 차 항체 인큐베이션 후, 막을 철저히 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하고 배경 신호를 감소시킨다. 이 세척 단계는 표적 단백질의 특정 검출을 보장하기 위해 중요합니다.
7. 이차 항체 인큐베이션 (리포터 효소와 접합) :
- 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) 또는 알칼리성 포스파타제 (ALP)와 같은 효소에 접합 된 이차 항체를 사용하여 막상의 1 차 항체- 항원 복합체를 검출한다.
- 2 차 항체는 종- 특이 적이며, 이는 특정 종 (예 :마우스 또는 토끼)에서 생성 된 1 차 항체를 인식하고 결합한다는 것을 의미합니다.
- 효소- 접합 된 이차 항체는 1 차 항체에 결합하여 신호 증폭 및 시각화를 허용하는 복합체를 생성한다.
8. 세척 :
- 다른 세척 단계가 수행됩니다. 결합되지 않은 2 차 항체를 제거하고 배경 신호를 줄입니다.
9. 화학 발광 검출 :
-HRP- 접합 된 이차 항체의 경우, 화학 발광 기질이 막에 첨가된다. 기판이 HRP와 반응하면 빛을 방출합니다.
- 특수 화학 발광 검출 시스템 또는 X- 선 필름은 방출 된 광 신호를 캡처하고 시각화하는 데 사용됩니다. 빛의 강도는 샘플에 존재하는 표적 단백질의 양에 해당한다.
10. 데이터 분석 및 해석 :
- 발달 된 X- 선 필름 또는 디지털 화학 발광 이미지는 표적 단백질에 해당하는 밴드 또는 반점을 식별하기 위해 분석됩니다.
-이 밴드의 크기와 강도는 감지 된 단백질의 분자량, 풍부 및 번역 후 변형에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다.
이들 단계에 따라, 웨스턴 블 롯팅은 복잡한 단백질 혼합물에서 관심있는 단백질의 특이 적 검출 및 분석을 허용한다. 분자 생물학, 면역학 및 임상 진단을 포함한 다양한 생물학적 연구 분야에서 널리 사용됩니다.
