1. 간으로부터 분리 mRNA
* 조직 수집 : 과학자는 동물로부터 간 조직을 얻을 것입니다 (이상적으로는 개구리와 비슷한 종이지만 필요한 경우 다른 종일 수 있습니다).
* RNA 추출 : 그들은 표준 기술을 사용하여 간 조직에서 총 RNA를 추출합니다. 이 RNA는 mRNA 및 다른 RNA 유형을 모두 포함 할 것이다.
* mRNA 분리 : 그런 다음 Poly-A 선택이라는 기술을 사용하여 mRNA를 정화 할 것입니다. 이 과정은 대부분의 mRNA가 3 '끝에 폴리 A 꼬리를 가지고 있다는 사실을 악용합니다.
2. cDNA 라이브러리 생성
* 역전사 : 역전사 효소를 사용하여, 과학자는 단리 된 mRNA를 상보적인 DNA (cDNA)로 변환 할 것이다. 이 cDNA는 간에서 발현 된 유전자의 코딩 서열을 나타낸다.
* 클로닝 : cDNA 분자는 cDNA 라이브러리를 생성하기 위해 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 박테리오파지)로 클로닝 될 것이다. 이 라이브러리는 본질적으로 간에서 발현 된 모든 유전자를 저장합니다.
3. 관심 유전자 확인
* mRNA 시퀀싱 (RNA-Seq) : 과학자는 간에서 모든 mRNA를 시퀀싱 할 수 있습니다. 서열을 알려진 유전자의 데이터베이스와 비교함으로써, 이들은 관심있는 단백질을 암호화하는 mRNA를 확인할 수있다.
* 차동 디스플레이 또는 마이크로 어레이 분석 : 이러한 기술을 통해 과학자는 간에서 유전자 발현 패턴 (단백질이 생성되는 곳)을 다른 조직과 비교할 수 있습니다. 이것은 간에서 특별히 발현되는 유전자를 정확히 찾는 데 도움이 될 수 있습니다.
* 항체 스크리닝 : 단백질이 이미 알려진 경우, 과학자는 단백질에 특이 적으로 결합하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 항체를 사용할 수 있습니다. 이것은 단백질을 코딩하는 cDNA 클론을 직접 식별합니다.
4. 개구리 세포에서의 발현
* 유전자 클로닝 : 현재 cDNA 라이브러리에서 확인 된 관심 단백질을 암호화하는 유전자는 개구리 세포로 전달하는 데 사용될 수있는 벡터로 분리되어 클로닝되어야한다.
* 벡터 선택 : 벡터는 유전자가 전사되고 개구리 세포에서 번역되도록하기 위해 필요한 조절 요소 (프로모터, 폴리아 데 닐화 신호)를 함유해야한다.
* 형질 감염/주입 : 유전자를 함유하는 벡터는 개구리 세포에 도입된다. 이것에는 다른 방법이 있습니다.
* 형질 감염 : 화학 물질 또는 기타 방법을 사용하여 벡터를 배양 개구리 세포로 전달합니다.
* 주입 : 벡터를 개구리 배아에 직접 주입하거나 조직을 발달시키는 것.
* 검증 : 과학자는 개구리 세포에서 단백질이 생성되고 있는지 확인해야합니다.
* 면역 형광 : 형광 항체를 사용하여 세포 내부의 단백질을 검출합니다.
* 웨스턴 블롯 : 세포 용 해물에서 단백질을 검출하기 위해 항체를 사용하여.
* 기능 분석 : 단백질이 개구리 세포에서 예상되는 생물학적 활성을 갖는지 여부를 테스트한다.
주요 고려 사항 :
* 종의 차이 : 유전자는 다른 종에서 발견 될 수 있지만 개구리에서 조절되거나 발현되는 방식에는 차이가있을 수 있습니다. 벡터 또는 기타 실험 조건에 대한 조정이 필요할 수 있습니다.
* 유전자 조절 : 과학자는 개구리에서 유전자의 발현을 제어하는 조절 요소를 고려해야합니다. 이것들은 원래 종과 다를 수 있습니다.
* 윤리적 관심사 : 동물 모델과 관련된 연구는 윤리적 의미를 신중하게 고려해야합니다.
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