1. 관심 유전자 복제 :
* 유전자를 얻으십시오 : 이것은 다양한 방법을 통해 수행 할 수 있습니다.
* PCR 증폭 : 특정 프라이머를 사용하여 주형 (예를 들어, 게놈 DNA, cDNA)에서 유전자를 복사합니다.
* 제한 효소 소화 및 결찰 : 특정 효소로 유전자와 표적 벡터를 자르고 함께 결합합니다.
* 유전자를 합성 : 유전자 서열을 화학적으로 합성한다.
* 벡터에 삽입 : 유전자는 박테리아 내에서 복제 할 수있는 벡터 (예를 들어, 플라스미드)에 삽입된다. 이 벡터는 종종 다음과 같은 요소를 포함합니다.
* 복제 기원 : 벡터가 숙주 박테리아에서 복제 할 수 있습니다.
* 선택 가능한 마커 : 특정 항생제에 대한 내성을 제공하는 유전자로 벡터를 운반하는 박테리아를 선택할 수 있습니다.
* 프로모터 : 유전자 발현을 조절하여 관심 유전자가 전사되도록하는 서열.
* 리보솜 결합 부위 : 리보솜이 번역을 인식하고 시작하는 데 도움이되는 서열.
2. 변형 및 선택 :
* 박테리아를 변환 : 유전자를 함유하는 벡터를 박테리아 숙주 세포 (예를 들어, 대장균)에 소개합니다. 이것은 다음과 같은 방법을 통해 수행 할 수 있습니다.
* 열 충격 : 세포막의 투과성을 증가시키기 위해 박테리아를 짧은 열 펄스에 노출시킨다.
* 전기 천공 : 전기 펄스를 사용하여 세포막에서 임시 기공을 생성합니다.
* 선택 : 선택 가능한 마커를 사용하여 벡터를 성공적으로 수행 한 박테리아 식민지를 선택하십시오. 이것은 일반적으로 마커가 내성을 제공하는 항생제를 함유 한 한천 플레이트에서 박테리아를 재배하는 것을 포함합니다.
3. 단백질 발현 :
* 배양 박테리아 : 단백질 생산에 필요한 영양소와 조건을 제공하는 적절한 배지 (예를 들어, 액체 국물)에서 형질 전환 된 박테리아 세포를 성장시킵니다.
* 단백질 생성 유도 : 일부 벡터에는 유도 성 프로모터가 있습니다. 배양에 특정 화학 물질 (예 :IPTG)을 추가함으로써 관심 유전자의 전사 및 번역을 유발하여 단백질 생산을 유발할 수 있습니다.
* 표현 조건 최적화 : 단백질 생산을 극대화하기위한 성장 조건 (온도, pH, 폭기).
4. 단백질 정제 :
* 세포 용해 : 박테리아를 열어 단백질을 방출하십시오. 이것은 다음과 같은 다양한 방법을 통해 수행 할 수 있습니다.
* 초음파 처리 : 음파를 사용하여 세포벽을 방해합니다.
* 프랑스 언론 : 고압에서 작은 개구부를 통해 세포를 강제합니다.
* 효소 용해 : 세포벽을 분해하기 위해 효소를 사용합니다.
* 정제 : 세포 성분의 복잡한 혼합물로부터 표적 단백질을 분리한다. 여러 단계를 결합한 다양한 기술을 사용할 수 있습니다.
* 크로마토 그래피 : 특정 리간드에 대한 크기, 전하 또는 친화력에 기초하여 단백질 분리.
* 원심 분리 : 밀도에 따라 단백질 분리.
* 강수 : 화학 물질을 사용하여 용액에서 단백질을 침전시킵니다.
* 분석 : 다음과 같은 방법을 사용하여 정제 된 단백질을 특성화하십시오.
* SDS-PAGE : 순도 및 분자량을 평가합니다.
* 웨스턴 블 롯팅 : 단백질의 동일성을 확인합니다.
* 기능 분석 : 단백질의 활성 및 원하는 특성을 확인합니다.
5. 최적화 및 스케일 업 :
* 최적화 : 다음과 같은 매개 변수를 조정하여 전체 프로세스를 미세 조정하십시오.
* 박테리아 균주 : 효율적인 단백질 발현으로 알려진 균주를 선택하십시오.
* 벡터 설계 : 프로모터 및 기타 규제 요소를 최적화하십시오.
* 문화 조건 : 최적의 단백질 수율을 위해 온도, pH 및 영양분 조성을 조정하십시오.
* 스케일 업 : 단백질에 대한 수요를 충족시키기 위해 생산량을 늘리십시오. 이것은 종종 더 큰 발효기와 생물 반응기를 사용하는 것입니다.
주요 고려 사항 :
* 단백질 용해도 : 일부 단백질은 박테리아 내에서 불용성 형태 (포함 체)로 발현 될 수있다. 이것은 단백질을 용해하고 다시 폴드하기위한 특별한 기술이 필요합니다.
* 독성 : 당신이 생산하는 단백질은 박테리아 숙주에 독성이있을 수 있으며, 생산을 관리하기위한 특정 전략이 필요합니다.
* 번역 후 수정 : 단백질이 박테리아에 자연적으로 존재하지 않는 특정 변형 (예를 들어, 글리코 실화)이 필요한 경우 포유 동물 세포와 같은 대체 발현 시스템이 필요할 수 있습니다.
박테리아 발현 대안 :
박테리아 발현 시스템은 대량의 단백질을 생산하는 데 널리 사용되지만 다른 옵션이 있습니다.
* 효모 시스템 : 박테리아보다 진핵 생물과 유사하여 더 나은 폴딩 및 글리코 실화 능력을 제공합니다.
* 포유 동물 세포주 : 보다 정확한 번역 후 변형과 더 높은 수율의 복잡한 단백질을 제공 할 수 있습니다.
* 곤충 세포 : 항체와 같은 복잡한 단백질을 발현하는 데 사용됩니다.
발현 시스템의 선택은 특정 단백질과 의도 된 사용에 달려있다.
