PCR을위한 프라이머를 만드는 방법

주요 영역이 적용됩니다

1. 프라이머는 무엇입니까
- 정의, 유형, 역할
2. 프라이머는 PCR에서 어떻게 작동합니까
- DNA의 특징, PCR의 과정
3. PCR을위한 프라이머를 만드는 방법
- PCR 프라이머를 설계하는 기본 규칙
4. 시퀀싱 프라이머를 설계하는 방법
- 시퀀싱 프라이머의 특징

주요 용어 :DNA 합성, 전방 프라이머, 길이, 용융 온도, PCR, 리버스 프라이머, 시퀀싱 프라이머

프라이머

프라이머는 DNA 합성의 출발점으로서 작용하는 짧은 DNA 또는 RNA가 있습니다. DNA 복제를 촉매하는 효소는 기존 3 '말단에 뉴클레오티드를 첨가 할 수있다. 따라서 프라이머는 프라임 역할을함으로써 DNA 합성의 기초를 놓습니다. RNA 프라이머 DNA 폴리머 라제에 의한 DNA 복제의 개시를 위해 세포 내부에서 사용된다. 그러나 합성 DNA 프라이머 주로 PCR 및 기타 기술에 의해 DNA의 증폭에 사용될 수있다. 두 가지 유형의 프라이머가 PCR에 사용되며, 전방 및 리버스 프라이머로 알려져 있습니다. PCR 동안, 원하는 DNA 단편의 수백만 카피는 전방 및 역방향 프라이머에 의해 게놈 DNA에서 특정 DNA 서열을 측면으로 만들어 생성 될 수있다. 측면에 특정 DNA 서열을 측면으로하는 전방 및 역 프라이머는 그림 1 에 나와 있습니다. .

그림 1 :전방 및 리버스 프라이머

프라이머는 PCR에서 어떻게 작동합니까

DNA는 함께 고정 된 두 가닥을 가진 분자입니다. 기본 쌍 패턴은 두 가닥에서 각각에 상보 적입니다. 두 가닥은 상보적인 질소 염기 사이의 수소 결합에 의해 함께 유지된다. 또한 각 가닥에는 고유 한 방향이 있습니다. 한 가닥은 5'TO 3 '방향성을 가지며, 다른 가닥은 3'내지 5 '방향성을 갖는다. 따라서, 두 가닥은 항구 평행이다. 5 '내지 3'방향을 갖는 가닥은 감지 가닥으로 알려져 있으며 3 '내지 5'방향을 갖는 가닥은 안티센스 가닥으로 알려져있다. 각각의 두 가닥은 PCR.

PCR의 세 단계는 변성, 어닐링 및 신장입니다. 변성에서, 2 가닥의 DNA는 95 ℃로 가열함으로써 수소 결합을 파괴함으로써 분리된다. 전방 프라이머는 감지 가닥에 결합하는 반면 역 프라이머는 안티센스 가닥에 결합합니다. 프라이머의 어닐링은 온도가 95 ° C에서 50-60 ° C로 떨어질 때 발생합니다. 따라서 두 가닥은 taq 의 도움으로 동시에 합성 될 수 있습니다. 폴리머 라제. 감각과 안티센스 가닥의 증폭은 5 '내지 3'방향으로 발생한다. PCR이 지수 반응이므로, 3 단계는 25-35 사이클로 반복됩니다. 전방 및 역방향 프라이머는 각 사이클에서 약 2 카피의 원하는 DNA 단편을 생성하기 위해 사용된다. PCR에서 프라이머의 역할은 그림 2 에 나와 있습니다. .

그림 2 :PCR

PCR 용 프라이머를 만드는 방법

게놈에서 특정 DNA 단편을 증폭시키기 위해, 특정 DNA 단편은 전방 및 역방향 프라이머 모두에 의해 측면되어야합니다. 따라서, 두 프라이머는 DNA 단편을 측면으로하는 서열을 보완해야한다. PCR 프라이머의 성공적인 설계에 대한 기본 지침은 다음과 같습니다.

1. 전방 및 리버스 프라이머의 방향은 5 ′ ~ 3 '이어야합니다.
2. 각 프라이머의 길이는 길이가 18 ~ 25 뉴클레오티드 사이이어야합니다.
3. 프라이머의 GC 함량은 40 ~ 60%이며 프라이머 3'end에서 c 또는 g의 존재는 결합을 촉진 할 수 있습니다.
4. 프라이머 쌍의 녹는 온도와 tm (프라이머의 절반이 템플릿에 어닐링 된 온도)은 유사하고 60 ° C 이상이어야합니다. 최대 차이는 5 ° C이어야합니다.
5. 프라이머의 3 '끝은 템플릿 DNA와 정확히 일치해야합니다.
6. 최소 2G 또는 C베이스 (GC 클램프)는 프라이머의 3 '말단에 마지막 5베이스에 존재해야합니다. GC 클램프는 대상 서열에 대한 강한 결합을 촉진합니다.
7. 5-6 개의 뉴클레오티드가있는 제한 사이트는 프라이머의 5 '엔드에 추가 할 수 있습니다.
8. 디 뉴클레오티드 반복 (atatatat) 또는 동일한 뉴클레오티드의 반복은 프라이머 서열에서 피해야합니다. 이것은 오해를 유발합니다.
9. 프리미어 내 상 동성 또는 프라이머의 2 차 구조를 피해야합니다. 전방 및 리버스 프라이머의 프리메이션 상 동성 또는 보완 서열을 피해야합니다. 두 조건 모두 자체 다이머 또는 프라이머 다이머를 형성 할 수 있습니다.
10. 이량 체 분석의 ΔG 값은 0에서 -9 kcal/mole 사이 여야합니다.

프라이머 3, 프라이머 X, NetPrimer, dnastrar 등과 같은 프라이머 디자인의 용이성을 위해 많은 온라인 도구가 제공됩니다. 설계 프라이머의 특이성은 NCBI 프라이머 블라스트 또는 UCSC 실리코 PCR과 같은 도구에 의해 결정될 수 있습니다. 

그림 3 :프라이머 3 인터페이스

시퀀싱 프라이머를 설계하는 방법

시퀀싱 프라이머는 PCR 프라이머와 마찬가지로 DNA 가닥이 짧습니다. 그러나, PCR 프라이머는 특정 DNA 단편의 증폭을 위해 설계되는 반면, 시퀀싱 프라이머는 PCR에 의한 증폭 된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 나타내는데 사용된다. PCR 프라이머와 달리, 단일 프라이머는 시퀀싱에 사용될 수 있습니다. 표적 서열만이 길이가 500 bp 미만인 경우. 예를 들어, PCR의 전방 프라이머는 시퀀싱에 사용되어 감지 가닥 만 증폭시킬 수있다. 또한, 시퀀싱 반응 동안 내성 된 불일치의 정도는 PCR보다 높다. 일반적으로, PCR 프라이머는 표적 서열에 상보 적이다. 그러나 일부 시퀀싱 프라이머는 표적 서열과 관련이 없습니다. 그것들은 범용 프라이머로 알려져 있습니다. T7 또는 SP6 어닐링과 같은 범용 프라이머는 표적 서열을 전달하는 벡터에 대한 어닐링. 그들은 다양한 벡터와 다양한 유형의 DNA 단편 모두에 사용될 수 있습니다.

결론

프라이머는 PCR에 사용되며 DNA 합성의 개시를 위해 시퀀싱이 사용됩니다. 두 가지 유형의 PCR 프라이머는 전방 및 역 프라이머로 식별 될 수 있습니다. 앞쪽 프라이머는 감각 가닥에 어닐링하는 동안 리버스 프라이머는 안티센스 가닥에 어닐링됩니다. 시퀀싱에서, 정방향 또는 리버스 프라이머를 사용하여 표적을 증폭시킬 수있다. 프라이머 설계 중에 프라이머 길이, TM 및 GC 함량과 같은 많은 요소가 고려되어야합니다. 특정 시퀀스를위한 프라이머 설계에 사용할 수있는 많은 온라인 도구를 사용할 수 있습니다.

참조 :

1.“프라이머 디자인 :효율적인 프로세스를위한 팁.” Genome Compiler Corporation, 2015 년 11 월 3 일, 여기에서 제공됩니다.
2.“시퀀싱 프라이머 및 프라이머 설계.” 캘거리 대학교, 시퀀싱 프라이머 및 프라이머 디자인, 여기에서 구할 수 있습니다.

이미지 제공 :

1. Zephyris의“Primers Revcomp”-Commons Wikimedia
2를 통한 자신의 작업 (CC By-SA 3.0). Enzoklop의“중합체 연쇄 반응”-Commons Wikimedia를 통한 자체 작업 (CC By-SA 3.0)