세포 용해 :
- 용해 절차는 일반적으로 NAOH를 함유 한 완충액에서 박테리아 세포의 재현 탁으로 시작합니다. 이 완충액은 pH가 높은 알칼리 환경을 생성하며, 일반적으로 pH 12-12.8 정도입니다.
-이 높은 pH에서, 박테리아의 세포막 및 세포벽이 파괴되어 세포 용해가 발생한다. 플라스미드 DNA를 포함한 세포 성분은 용 해물로 방출된다.
염색체 DNA의 변성 :
-NAOH에 의해 생성 된 높은 pH 환경은 구체적으로 박테리아의 염색체 DNA를 표적으로하고 거부합니다. 염색체 DNA는 전형적으로 크고 복잡하며 단일 원형 분자로 구성됩니다.
- 강한 알칼리성 조건은 상보적인 DNA 가닥 사이의 수소 결합을 유발하여 파손되어 염색체 DNA의 변성 및 단편화를 초래합니다. 이러한 변성은 염색체 DNA의 구조적 무결성을 효과적으로 방해하여 기능을하지 않습니다.
플라스미드 DNA의 보존 :
- 염색체 DNA와 달리, 플라스미드 DNA는 NaOH에 의한 변성에 더 내성이있다. 플라스미드 분자는 일반적으로 작고 원형 및 이중 가닥이며 안정성을 향상시키는 슈퍼 코일 구조가 있습니다.
- 플라스미드 DNA의 슈퍼 코일 형태는 염색체 DNA보다 알칼리성 조건을 견딜 수있게한다. 따라서, 염색체 DNA가 변성되는 동안, 플라스미드 DNA는 그대로 유지되며 공유 폐쇄 원형 구조를 유지한다.
중화 :
- 용해 단계 후, 변성 된 염색체 DNA 및 온전한 플라스미드 DNA를 함유하는 용 해물은 TRIS-HCL 또는 아세테이트 완충제와 같은 중화제를 함유하는 완충제를 사용하여 중화된다.
- 중화는 용 해물의 pH를 생리 학적 범위, 일반적으로 pH 7-8 정도로 되돌립니다. 이 단계는 변성 과정을 중지하고 플라스미드 DNA의 안정성을 보장하는 데 필수적입니다.
플라스미드 DNA의 분리 :
- 중화 후, 용 해물은 플라스미드 DNA를 분리하기 위해 추가로 처리 될 수있다. 이것은 원심 분리, 정제 및 크기 기반 분리 기술과 같은 추가 단계를 포함하여 다른 세포 성분들로부터 플라스미드 DNA를 분리하기위한 추가 단계를 포함 할 수있다.
플라스미드 DNA의 완전성을 보존하면서 염색체 DNA를 선택적으로 변성시킴으로써, NaOH는 용해 절차에서 중요한 역할을하며, DNA 시퀀싱, 클로닝 및 유전자 공학 실험을 포함한 다양한 다운 스트림 응용 분자에 대한 공유 폐쇄 플라스미드 분자의 효율적인 분리를 가능하게한다.
